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时间:2020-06-04 19:35  编辑:永胜猪肉价格

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·论著·丹参酮ⅡA对心肌梗死模型大鼠心肌

钙调蛋白及心功能的影响

李小燕 黄萍 陈少秀 彭吉霞

【摘要】目的观察丹参酮ⅡA对心肌梗死模型大鼠心肌钙调蛋白(cardiac muscle, CaM)及钙调蛋

白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependentproteinkinase-Ⅱ, CaMKⅡ)mRNA表达和心功能的影

响。方法 100只大鼠按随机数字表法分为假手术组、模型组、丹参酮ⅡA组。模型组、丹参酮ⅡA组采

用结扎左侧冠状动脉前降支45 min再灌注45 min,并反复3次阻断与再灌注的方法建立大鼠心肌梗死模

型。丹参酮ⅡA组尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液10 mg/kg,假手术组、模型组尾静脉注射等体积

生理盐水。连续给药7 d后断头处死,取心脏用Langendorff离体心脏灌流器灌流离体心脏,测定各组大

鼠给药前后离体心脏左室最大上升/下降速率(±LVdp/dtmax)、心肌收缩张力、心率等心功能指标;TTC

染色观察心肌梗死面积;检测缺血区心肌组织CaM及CaMKII mRNA表达。结果与模型组比较,丹参

酮ⅡA组CaM mRNA[(1.29±0.19)比(2.31±0.21)]及CaMKⅡ mRNA[(1.10±0.07)比(2.13±0.18)]表

达下调(P<0.05),心肌梗死范围[(25.12±0.43)%比(35.15±0.64)%]缩小(P<0.05),心肌收缩张力

[(2.03±0.14)g比(1.06±0.12)g]及±LVdp/dtmax[(4 701.2±135.3)mmHg/s比(3 214.7±110.2)mmHg/s;

(2 518.7±65.4)mmHg/s比(1 960.3±62.5)mmHg/s]增高(P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可下调急性心肌梗

死模型大鼠心肌细胞CaM、CaMKⅡ mRNA表达,对心肌缺血有保护作用。

【关键词】丹参酮ⅡA;心肌梗塞;钙调蛋白;钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;大鼠

Effect of tanshinone IIA on the calmodulin and heart function of the rats with acute myocardial infarction Li Xiaoyan*, Huang Ping, Chen Shaoxiu, Peng Jixia. *Shiyan Taihe Hospital

Affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, China

Corresponding author: Peng Jixia, Function of the Laboratory, Hubei Medical College, Shiyan 442000, China;

Email: [email protected]

【Abstract】Objective To observe the effect of tanshinone IIA on the myocardial calmodulin (CaM)

and calmodulin dependent protein kinase II (CaMK) mRNA expression and heart function of acute myocardial

infarction rats. Methods A total of 100 rats were randomly divided into the sham operation group, the model

group, and the tanshinone ⅡA group. The model of acute myocardial infarction was established by the ligation

of left anterior descending coronary artery ligation with 45 min, and reperfusion with 45 min, and the above

process was repeated 3 times. Tanshinone IIA group was treated with intravenous injection of 10 mg/kg sodium

tanshinone ⅡA, while the sham operation group and the model group with 10 mg/kg saline, and all treatment

last 7 days. The mRNA expressions of CaM and CaMKII were determined. TTC staining was used to observe

areas of myocardial infarction. The left ventricular maximum rise/fall rate (±LVdp/dtmax), myocardial

contraction tension, heart rate and heart function index were detected pre- and post-treatment by the Langendorff

device perfusion of isolated heart. Results Compared with the model group, the mRNA expression of and

CaM mRNA (1.29 ± 0.19 vs. 2.31 ± 0.21) and CaMK II (1.10 ± 0.07 vs. 2.13 ± 0.18) in the tanshinone IIA group

were significantly lower (P<0.05), and the areas of myocardial infarction (25.12% ± 0.43% vs. 35.15% ± 0.64%)

DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-4246.2016.08.016

作者单位:442000 湖北省十堰市太和医院湖北医药学院附属医院(李小燕、黄萍、陈少秀);442000十堰,湖北

医药学院机能实验室(彭吉霞)

通信作者:彭吉霞,Email: [email protected]

significantly decreased (P<0.05), and the IT (2.03 ± 0.14 g vs. 1.06 ± 0.12 g), the ±LV dp/dtmax (4 701.2 ± 135.3 mmHg/s vs. 3 214.7 ± 110.2 mmHg/s, 2 518.7 ± 65.4 mmHg/s vs.1 960.3 ± 62.5 mmHg/s) significantly increased (P<0.05). Conclusion Tanshinone IIA may protect myocardial ischemia by regulating the mRNA expression of CaM and CaMKⅡ.

【Key words】 Tanshinone IIA; Myocardial infarction; Calmodulin; Calmodulin dependent protein kinase II; Rats

急性心肌梗死后心肌会发生电生理重构,直接影响心肌收缩与舒张。心肌的收缩/舒张与Ca2+内流密切相关,Ca2+作为胞浆内第二信使,与钙调蛋白(cardiac muscle, CaM)形成Ca2+-CaM复合物后,进一步激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependentproteinkinase-Ⅱ, CaMKⅡ)。CaMKⅡ是研究抑制心肌梗死后恶性心律失常药物的新靶点[1-3]。本研究采用Langendorff离体心脏灌流法观察丹参酮ⅡA对心肌梗死模型大鼠心脏的影响,并检测大鼠缺血区心肌组织CaM、CaMKⅡ mRNA表达,探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物:SPF级SD大鼠100只,体重180~ 220 g,雌雄不限,购自湖北医药学院实验动物中心,动物合格证号SYXK(鄂)2011-0031。分笼饲养,24 h交替光照,动物房温度18~25 ℃,湿度50%~75%,自由饮水,普通饲料喂养。

1.2 仪器及药品:BL-420F生物信号采集记录系统、Langendorff-Perfused离体心脏模型监测仪、HX-300小动物呼吸机(成都泰盟电子有限公司);丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(上海第一生化药业有限公司,批号H31022558);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,上海沪震实业有限公司,批号06011026);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司,批号061222)。1.3 分组及模型制备:参考文献[4]方法,按随机数字表法将大鼠分为假手术组30只、造模组70只。造模组大鼠胸腹部皮肤碘伏消毒,3%戊巴比妥钠(30 mg/100 g体重)腹腔注射麻醉,腹部向上仰卧位固定于鼠台后,接小动物呼吸机并调整潮气量,使麻醉大鼠呼吸与小动物呼吸机频率同步,连接BL-420F生物信号采集记录系统记录大鼠Ⅱ导联心电图。5~6肋间开胸并用拉勾扩开肋缘暴露心脏,剪开心包用玻璃分针向右轻轻按压心脏以充分暴露冠状动脉左前降支,微创园缝合针自肺动脉圆锥进针、从左心房边缘后外测出针,于缝合线与心脏前降支表面置一软管,拉紧缝合线结扎左侧冠状动脉前降支45 min再灌注45 min,并反复3次阻断与再灌注的方法建立急性心肌梗死大鼠模型。以心电图在结扎左侧冠状动脉前降支后立刻出现新的Q波、ST段抬高、T波高耸或倒置等急性心肌梗死心电图改变,且大鼠术后存活1 d 以上者为造模成功。本实验造模后存活62只,存活率为88.5%,将其中60只采用随机数字表法分为模型组、丹参酮ⅡA组,每组30只。假手术组仅开胸不结扎左侧冠状动脉前降支。

1.4 给药方法:根据人与动物体表面积换算公式[5],丹参酮ⅡA组大鼠尾静脉注射丹参酮ⅡA磺酸钠注射液10 mg/kg,假手术组、模型组尾静脉注射等体积生理盐水。均连续给药7 d。

1.5 大鼠心肌组织TTC染色:参考文献[6]方法,末次给药后,每组各取6只大鼠断头处死,剪下心脏,-80 ℃超低温冰箱冷冻5 min后沿左心室长轴将心室水平切片(厚约2~3 mm),置于37 ℃,浓度为1%的TTC溶液(pH 8.5)中温孵30 min染色。TTC染色后梗死心肌呈灰白色,缺血区心肌呈红色,精确分离左心室称重,以梗死区面积占心室面积的百分比为心肌梗死范围。

1.6 大鼠心肌组织钙调蛋白、钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡmRNA检测:于给药前及给药后7 d,每组各取6只大鼠断头处死,取心脏左室游离心肌

组织放入预冷匀浆液中,制备组织匀浆,5 000 r/min 低温离心20 min ,取上清液待测。提取上清液总RNA ,逆转录为cDNA ,以其为模板加入引物进行PCR 扩增。引物序列见表1。反应条件如下:95 ℃预变性5 min 后,按95 ℃ 30 s 、58 ℃ 30 s 、72 ℃ 30 s 扩增40个循环后,72 ℃延伸10 min 、50 ℃ 2 min 。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,采用美国Bio-Rad 蛋白凝胶系统分析软件Quantity One 对电泳条带进行吸光度扫描分析,以内参β-actin 吸光度值进行校正,计算CaM 、CaMK Ⅱ mRNA 表达。

表1 目的基因引物序列表

指标 引物序列

扩增产物 长度(kDa )

CaMKII 上游:5’-GCTCACGCACTCGGTGCTCA-3’ 115 下游:5’-CCAGGCTCCAGAAGAAG -3 CaM 上游:5’-GCTCACAAGATCAAGTCGCA-3’ 187 下游:5’-CGAGCCTCGACACCACG -3 β-actin 上游:5’-GCACATGGACTGGGTGCGCA-3’ 134

下游:5’-GCAGGCTCGACGACCACG -3

注 CaM :钙调蛋白;CaMK Ⅱ:钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ

1.7 心脏灌流方法:参考文献[7]方法,于给药前及给药后7 d ,每组各取6只大鼠,均经尾静脉注入1 000 U 肝素(0.2 ml/100 g )抗凝,30 min 后断头处死,打开胸腔,预留主动脉3~4 mm ,剪下心脏,迅速放入用5% CO 2+95% O 2充分饱和的预冷Krebs-Henseleit (K-H )液中,冲洗心脏内残血,将Langendorff 灌注管从预留的主动脉插入。用37 ℃饱和K-H 液进行心脏逆行灌注使心脏复跳,于左心耳处剪一小口,将乳胶水囊测压管经二间瓣插入左心室并连接压力换能器,采用生物信号采集记录系统观察并调节水囊,使左室舒张末压到7 mmHg

(1 mm Hg =0.133 kPa )。预灌流30 min 后,采用K-H 液将丹参酮ⅡA 磺酸钠注射液稀释至浓度为10-2 mol/L ,并对丹参酮ⅡA 组进行灌流,模型组及假手术组仅灌流K-H 氏液。记录给药前后左室最大上升/下降速率(±LVdp/dtmax )、心肌收缩张力、心率等心功能指标。

1.8 统计学方法:采用SPSS 19.0软件进行数据处理。计量资料以s x ±表示,组间比较采用单因素方差分析。P <0.05为差异有统计学意义。 2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织钙调蛋白、钙调蛋白依赖性蛋白激酶ⅡmRNA 表达比较:与假手术组比较,模型组CaM 及CaMK Ⅱ mRNA 表达增高(P <0.05);丹参酮ⅡA 组CaM 及CaMK Ⅱ mRNA 表达较模型组及同组给药前降低(P <0.05),见表2。

表2 各组大鼠给药前后CaM 及CaMK ⅡmRNA 表达比较 (s x ±)

组别

只数

CaM mRNA

CaMK ⅡmRNA 给药前

给药后

给药前

给药后

假手术组 6 1.11±0.03 1.21±0.04 1.07±0.04 1.02±0.05模型组 6 2.15±0.07 2.31±0.21a 2.03±0.13 2.13±0.18a 丹参酮ⅡA 组

6 2.13±0.09 1.29±0.19bc 2.01±0.09 1.10±0.07bc

注 CaM :钙调蛋白;CaMK Ⅱ:钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ;与假手术组给药后比较,a P <0.05;与模型组给药后比较,b P <0.05;与同组给药前比较,c P <0.05

2.2 各组大鼠心肌梗死范围比较:模型组心脏出现明显的梗死区,丹参酮ⅡA 组心肌梗死范围低于模型组(P <0.05),见表3。

2.3 各组大鼠心肌收缩张力、心率、左室最大上升/下降速率比较:与假手术组比较,模型组心肌收缩张力、±LVdp/dtmax 降低、心率减慢(P <

表3 各组大鼠心肌梗死范围比较(s x ±)

组别

只数 坏死区(g ) 非坏死区(g ) 左室重量(g ) 梗死范围(%) 假手术组

6

0.468 8±0.042 5

0.468 6±0.045 2

模型组 6 0.316 7±0.086 3a

0.212 1±0.025 4a

0.567 9±0.065 7 35.15±0.64a 丹参酮ⅡA 组 6 0.206 5±0.065 9ab 0.385 6±0.030 5ab 0.486 5±0.024 1

25.12±0.43ab

注 与假手术组比较,a P <0.05;与模型组比较,b P <0.05

0.05)。给药后丹参酮ⅡA组±LVdp/dtmax、心肌收缩张力较模型组及同组给药前提高(P<0.05),见表4、表5。

3讨论

丹参酮ⅡA磺酸钠注射液是从中草药丹参块茎中纯化分离的二萜醌类化合物经磺化反应制成的灭菌注射液,主要药理成分有丹参酮甲酯、丹参酚酸及丹参酮ⅡA等[8-10]。其中丹参素及丹参酮ⅡA具有降低血液黏稠度,清除氧自由基,扩张冠状动脉,增加缺血心肌组织血流量,抑制缺血区组织细胞内钙超载的作用;可扩张急性心肌梗死模型大鼠冠状动脉、增加心肌能量储备、增强心肌收缩力,提高机体耐缺氧能力[11-12]。

在对心功能评价时,±LVdp/dtmax是心室收缩与舒张功能的重要指标,与心肌收缩与舒张呈正相关,+dp/dtmax增加代表心肌收缩力增强, -dp/dtmax数值增加代表心肌舒张功能降低。同时+dp/dtmax可间接反映心肌收缩的缩短速度, -dp/dtmax则直接反映左心室的舒张时程,时程延长则间接说明心室收缩与舒张功能降低。心肌收缩张力直接反应心肌收缩力、心率反应心脏收缩的频率,心肌收缩张力及心率的变化均是真接反映心功能的指标[13]。本研究显示,模型组心肌收缩张力、心率及±LVdp/dtmax均下降,这可能是受心肌梗死后造成电生理重构的影响[14]。与模型组比较,丹参酮ⅡA组CaM、CaMKⅡmRNA降低,心肌收缩张力、±LV dp/dtmax增高,这可能与心肌梗死导致的钙超载后,丹参酮ⅡA可抑制心肌细胞内CaM的活化,进而抑制心肌CaMKⅡ活性有关,丹参酮ⅡA可减少Ca2+内流,使心肌正常除极完全舒张,心肌在完除极后,Ca2+通过L 型钙通道内流、肌浆网上ryanodine受体与钙调蛋白正常结合而促使心肌收缩力增强并最终增高±LVdp/dtmax、扩张冠状动脉,避免由钙稳态失衡诱导心肌梗死,发挥心肌保护作用。

综上所述,丹参酮ⅡA可能通过降低CaM、CaMKⅡmRNA表达,减少梗死心肌Ca2+内流,进而减少钙超载的发生。同时,丹参酮ⅡA可拮抗内皮素、清除自由基、有效调节血管收缩功能、降低血液黏稠度、改善血液微循环、扩张微循环促进血液回流,提高心肌细胞耐缺氧能力,增强心肌收缩力,扩张冠状动脉进而迅速逆转急性心肌梗死缺血引起的心脏功能障碍等[15]。

表4 各组大鼠给药前后心肌收缩张力及心率比较(s

x±)

组别只数

心肌收缩张力(g)心率(次/min)

给药前给药后给药前给药后

假手术组 6 1.93±0.15 1.94±0.16 496.3±40.2 491.3±39.7 模型组 6 0.97±0.16 1.06±0.12a 315.7±29.8 307.3±28.5a 丹参酮ⅡA组 6 1.01±0.14 2.03±0.14bc 313.5±27.4 311.7±30.3 注 与假手术组给药后比较,a P<0.05;与模型组给药后比较,b P<0.05;与同组给药前比较,c P<0.05

表5各组大鼠给药前后±LVdp/dtmax比较(mmHg/s,s

x±)

组别只数

+LVdp/dtmax -LVdp/dtmax

给药前给药后给药前给药后

假手术组 6 4

937.9±115.8 5

040.2±175.7 2

595.4±90.1 2

672.4±71.8

模型组 6

3

141.7±104.2 3

214.7±110.2a 2

012.6±75.3 1

960.3±62.5a

丹参酮ⅡA组 6 3

193.4±107.9 4

701.2±135.3bc 2

032.4±82.7 2

518.7±65.4bc 注±LVdp/dtmax:左室最大上升/下降速率;1 mm Hg=0.133 kPa;与假手术组给药后比较,a P<0.05;与模型组给药后比较,b P<0.05;与同组给药前比较,c P<0.05

参 考 文 献

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1672-5301.2015.04.020.

(收稿日期:2015-10-21)

(本文编辑:张琪)

·预防接种宣传·

流行性乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、百日咳和白喉等传染病控制情况如何?

随着流行性乙型脑炎疫苗的广泛应用和卫生条件改善等,流行性乙型脑炎发病率大幅下降,目前全国流行性乙型脑炎报告发病率降至0.1/10万以下的水平。流行性脑脊髓膜炎疫苗纳入国家免疫规划后,发病率逐年降低,2015年全国流行性脑脊髓膜炎报告发病率低于0.01/10万。20世纪50年代和60年代初期,每年我国报告白喉病例上万例,自1978年实施计划免疫后,白喉发病率大幅度下降,目前我国已连续多年无白喉病例报告。在未使用疫苗前,百日咳是儿童常见疾病和死亡原因,我国20世纪50年代至70年代百日咳发病率均在100/10万以上,在1959年和1963年出现的大流行中有近万名儿童死于百日咳,而近年来百日咳的发病率已降至1/10万以下。

(来源:中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会宣传司)

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