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时间:2020-05-22 04:37  编辑:富顺肺炎

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KGF对肠上皮细胞IL-7表达调控及对缺血再灌注损伤条件下肠黏保护作用及其机制研究

邱远,蔡瑜娇,王文生,陈国庆,许超,孙力华,肖卫东,杨桦*

【摘要】

目的肠道急性缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤可引起肠黏膜上皮细胞脱落,肠黏膜通透性增加,引起细菌、毒素入血,从而引发严重的并发症。尽管已知角质生长因子(KGF)对肠黏膜细胞生长具有重要作用,但其在肠道急性I/R损伤中的作用及机制尚不清楚。方法肠梗阻病例的肠道组织用于形态学分析,并用免疫荧光的方法检测IL-7的表达。用KGF作用LoVo细胞和C57BL/6J小鼠。用WB和免疫荧光的方法检测KGF、KGF受体(KGFR)及IL-7的表达。结果肠梗阻致缺血肠道KGF,IL-7表达下调;在体内和体外研究中发现,KGF可上调IL-7的表达;在LoVo细胞中,KGF作用引起磷酸化STAT1表达升高,用雷帕霉素或AG490阻断后,KGF的作用不能上调磷酸化STAT1和IL-7的表达;同时,KGF可上调IRF-1和IRF-2的表达;KGF可以显著改善急性I/R所致的肠黏膜形态的损伤及紧密连接蛋白正常表达结构的破坏。结论在急性I/R小鼠模型中,KGF对I/R所致的肠黏膜形态及肠黏膜屏障功能损伤具有明确的保护作用。KGF可上调IL-7的表达,这一调控是通过KGFR/STAT1/IRF-1,IRF-2通路实现的。本研究首次提出KGF通过KGFR/STAT1/IRF-1,IRF-2通路调控IL-7的表达,并参与调节肠黏膜屏障功能。

【关键词】

角质细胞生长因子(KGF);白介素7(IL-7);缺血再灌注(I/R),小鼠,肠上皮细胞;肠黏膜屏障功能;信号传导与转录活化因子(STAT1);干扰素调控因子1和2(IRF-1,IRF-2)

KeratinocyteGrowthFactor-inducedSignalsUp-regulateInterleukin-7ProductionandImproveIntestinalStructureandFunctioninIntestinalIschemia/ReperfusionInjury

YuanQiu,YujiaoCai,WenshengWang,GuoqingChen,ChaoXu,LihuaSun,WeidongXiao,HuaYang*

Backgrond&Aims:Thepathogenesisofintestinalischemia/reperfusion(I/R)isbelievedtoinvolveanalterationofepithelialstructureandfunction.KeratinocyteGrowthFactor(KGF)mediatestheenterocytemitosisandincreasesintestinalgrowth.WehaveinvestigatedtheroleKGFplaysinregulatingintestinalepitheliumhomeostasisinresponsetoI/Rinjury.Methods:KGFandIL-7expressionwereevaluatedinintestinaltissuesamplesfrompatientswithintestinalobstruction.LoVocellsandadultC57BL/6JmiceweretreatedwithKGF.ExpressionofP-Tyr-STAT1,STAT1,andIL-7byinhibitingSTAT1andalterationsofexpressionofIRF-1,IRF-2andIL-7weremeasuredwithwesternblot.Epithelialcell(EC)proliferationandapoptosiswereassessed.Tightjunctions(TJ)weredetectedbywesternblotandimmunohistochemistry.Results:IntestinetissuefrompatientswithintestinalobstructionexpressedsignificantlylessKGFandIL-7thancontrols.KGFtreatmentledtoincreasedlevelsofP-Tyr-STAT1andIL-7expression.IRF-1andIRF-2expressionwerealsoup-regulatedbyKGF,andIL-7expressionwasdecreasedafterIRF-1andIRF-2weresilenced.MiceinjectedwithKGFwereprotectedagainstintestinalI/R;KGFstimulatedtherecoveryofmucosalstructuresandattenuatedthedisrupteddistributionofTJproteins.Conclusions:KGFandIL-7aredown-regulatedinintestinaltissueofpatientswithintestinalobstruction;KGFsignaling,viatheSTAT1/IRF-1,IRF-2signalingpathway,up-regulateIL-7expressioninEC.KGFadministrationimprovestheepithelialstructureandbarrierfunctioninamousemodelofintestinalI/R.

Keywords:Keratinocytegrowthfactor(KGF);Interleukin-7(IL-7);ischemia/reperfusion(I/R);mouse;intestinalepithelialcells;intestinalbarrierfunction;signaltransducersandactivatorsoftranscription1(STAT1);interferonregulatoryfactor1(IRF-1)andinterferonregulatoryfactor2(IRF-2).

肠道缺血再灌注(Intestinalischemia/reperfusion,I/R)所致损伤常见于多种临床疾病,如机械性肠梗阻,出血性休克、小肠移植、心肺转流术、腹部主动脉手术及血管手术等,严重时可诱发败血症及多器官功能衰竭,从而威胁患者的生命。肠道I/R损伤是一个涉及多个病理生理反应机制的复杂过程,包括全身的和局部的损伤,在这个过程中,最直接的是对肠黏膜的损伤[1]。这种急性I/R所致的肠黏膜损伤包括黏膜上皮的脱落、细菌移位、黏膜通透性改变及吸收功能的异常,进而导致全身炎性反应综合征、败血症及多器官功能衰竭,严重者引起患者死亡。

角质化细胞生长因子(keratinocytegrowthfactor,KGF),又称为FGF7,最早是从人胚胎肺成纤维细胞系M426中分离出来,具有促进上皮细胞分裂的作用。最初发现,KGF具有增强多种上皮细胞有丝分裂活性的作用。成年大鼠给予重组KGF后,发现大鼠全消化道肠黏膜上皮细胞及肝细胞显著增殖,并且杯状细胞的数量也显著增加[2]。在短肠综合征(SBS)发生时,作为一种适应性代偿的改变,由小肠隐窝细胞增殖始动,产生小肠黏膜吸收面积及体积的增加,同时可促进肠上皮细胞的增生及分化[3]。在广泛性肠切除(massivebowelresection)手术后给予外源性KGF,发现小肠黏膜湿重增加了约20%,表现在小肠黏膜厚度、绒毛高度及隐窝深度的增加,黏膜形态学的改变同时伴随着黏膜DNA、蛋白含量及酶活性的增加[4]。另外,我们的前期研究也证实了广泛性肠切除可促进小肠黏膜KGF表达上调,进一步研究发现,在SBS发生后,肠上皮间淋巴细胞(intraepitheliallymphocyte,IEL)来源的KGF表达上调,而IEL来源的KGF表达主要在隐窝部位,但在绒毛的底部及顶部KGF表达不明显,对-TCR-IEL敲除小鼠的研究发现,小肠黏膜萎缩达22%,说明IEL来源的KGF对维持肠上皮细胞的增殖和生长具有重要作用[5]。研究进一步发现,KGF刺激显著促进了Na+和Na+耦联的营养物质如葡萄糖、丙氨酸的吸收,增强了肠道的吸收功能。研究还发现KGF不仅可以抑制胃酸的分泌,还可以促进胃肠黏膜上皮细胞的增殖与分化以促进溃疡面的愈合[6]。我们前期的研究发现,在全胃肠外营养(TPN)的小鼠模型中,给予KGF能显著增强肠黏膜屏障功能,并且KGF能减轻化疗及放疗引发的黏膜损伤[7]。以上研究结果提示,KGF在肠黏膜慢性损伤中对肠功能的保护及损伤修复起重要作用;但其在急性I/R条件下对肠道的作用尚不清楚,在本研究中,我们将探讨KGF对急性I/R所致的肠黏膜结构及功能的损伤的保护作用[8]。

多项研究发现,肠上皮细胞通过与邻近的IEL的对话在肠黏膜免疫反应中发挥着重要作用。近来研究发现,IL-7在IEL的分化和成熟过程中起着重要作用,IL-7在肠黏膜免疫中的重要作用表现在其在促进T淋巴细胞的成熟过程中发挥特殊的作用,这一特殊作用是其他因子不能取代的[9]。在IL-7表达缺陷时,幼稚T细胞的增殖被抑制,并且数量也显著下降。在体内研究中发现,给与小鼠IL-7后,IEL的功能及数量都发生明显改变,表现为IEL数量的增加和细胞亚型的改变,而在IL-7过表达的TPN转基因小鼠模型中,IL-7过表达能减缓TPN所致多种IEL的细胞亚型的改变及对功能的影响[10]。以上研究结果提示:IL-7参与了IEL的生长过程并维持其作用的发挥,在肠免疫反应中发挥着重要的作用,但其调控的机制目前尚不清楚。我们在前期的研究中发现,IL-7过表达的转基因小鼠模型肠黏膜组织的KGF表达上调,首次提出KGF和IL-7这两个在肠道均具有重要作用的因子存在,并在IEL与IEC对话中扮演重要角色,即可能存在交互对话(CrossTalk)[11]。由于之前的研究并未涉及对IEC来源的IL-7的调控作用及相关机制,在本研究中,我们将就KGF对IL-7表达的调控作用及其调控机制进行研究。

1.材料与方法

1.1病例选择:37例患者因小肠梗阻行小肠部分切除术。在手术切除标本中取少量组织,4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋、切片、HE染色,具体方法同上,做病理学分析。

1.2实验动物及分组:实验动物:无特定病原,6-8周,C57BL/6J雄性小鼠,由本校动物实验中心提供。实验前在本所动物室饲养,恒温、恒湿及规定光照,普通鼠饲料喂养。实验前自由饮水。随机将实验动物分为假手术组(Sham组、I/R组及I/R+KGF组。其中,I/R组及I/R+KGF组分为0h,6h,24h,72h四个时相点[12,13]。KGF组小鼠的给药方法是:术前KGF(5mg/kg/d)腹腔注射×5天。每组小鼠各六只。对照组注射生理盐水。

1.3检测方法

1.3.1H.E.染色及免疫组化:组织石蜡切片二甲苯脱蜡和系列乙醇浓度梯度水化,苏木精染液染色,酒精脱水,二甲苯透明处理后中性树胶封固。免疫组化:常规对石蜡包埋的切片脱蜡脱水,蛋白酶K(20μg/ml溶于Tris/HCl中,pH7.4-8.0)室温孵育15-30min,PBS冲洗切片,滴加50μl的一抗反应混合溶液,在湿盒中37℃孵育,PBS冲洗切片3次,滴加二抗,在湿盒中37℃孵育30min,PBS冲洗切片3次;加入50-100μlDAB底物溶液,室温孵育10min,复染,封片,在光镜下分析结果(×400),光镜下每个样本随机计数7个视野。

1.3.2Westernblot:用蛋白测定试剂盒测定上清液蛋白含量。蛋白上样后80 V电泳2 h,100 V恒压湿转1 h至PVDF膜,转膜结束后用50 g/L的脱脂奶粉封闭1 h。分别加入一抗抗体(1:500)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH,1:1000),4℃冰箱12 h。TBST洗膜3次,每次10 min。然后加入二抗后室温孵育1 h。加入ECL化学发光试剂显影。

1.3.3免疫荧光:石蜡切片顺序乙醇脱水二甲苯脱蜡,0.03%双氧水消除内源性过氧化物酶活性,室温孵育10min,蒸馏水冲洗一次PBS浸泡5min,抗原修复0.4%胃蛋白酶溶液预先预热至37度切片也预热至37℃20min,PBS洗片,消除非特异性背景染色,滴加正常山羊血清封闭液室温20min甩去液体,无需再洗片,滴加一抗4℃过夜,之后37℃复温30min,滴加荧光素标记的二抗37℃孵育30min,PBS洗片,共聚焦显微镜观察。

1.3.4跨上皮电阻抗检测:获取小肠组织,沿肠系膜方向剪开肠管,在预冷的RPMI-1640培养基中清洗肠内容物。在解剖显微镜下仔细去除肠黏膜肌层,然后将其安装在已经调零后的Usingchambers上。跨上皮电阻可作为检测肠上皮屏障功能的一个指标

1.4统计学方法:

所有数据以均数±标准差(X±SD)表示,采用SPSS13.0统计学软件进行t检验及χ2检验,p。

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