实用医学杂志2012年第28卷第5期
动脉粥样硬化(AS )所致的心 、脑血管疾病是严重危害人类健康的疾病之一。随着研究的不断深入,炎症在AS 发病机制中的作用越来越为人们所重视。一氧化氮(NO )是以L-精氨酸为底物在血管内皮细胞一氧化氮合酶(eNOS )作用下合成的血管
舒张因子,具有扩张血管 、抑制白细胞黏附 、抑制血小板聚集和血管平滑肌增殖等作用,可延缓AS 进展 。肿瘤坏死因子-α(TNF -α)主要由激活的单核细胞、淋巴细胞分泌,是一种多功能的炎性细胞因子,参与炎症、免疫反应,能够促进AS 的发展 。故NO 、TNF -α可作为衡量AS 的相关指标,本研究拟通过建立载脂蛋白E 基因敲除(A poE -/-)小鼠AS 模型,检测阿托伐他汀干预治疗后血清NO 、TNF -α的表达,探讨阿托伐他汀抗AS 机制 。1材料与方法
1.1实验动物A poE -/-小鼠,24只,雄性,体重
doi :10.3969/j.issn.1006-5725.2012.05.010
基金项目:吉林省科技发展计划项目(编号:20070720-3)作者单位:130041长春市,吉林大学第二医院急救医学科(张
敏),心血管内科(宁亚媛,陈丽娟,王珺楠)
通信作者:陈丽娟
E -mail :[email protected]
阿托伐他汀对A poE -/-小鼠动脉粥样硬化模型中血清
一氧化氮 、肿瘤坏死因子-α表达的影响
张敏
宁亚媛陈丽娟王珺楠
摘要
目的:探讨阿托伐他汀抗动脉粥样硬化的机制。方法:24只载脂蛋白E 基因敲除小鼠随机分为
3组(n =8),分别给予普通饮食(空白对照组) 、高脂饮食(高脂饮食组)、高脂饮食+阿托伐他汀(高脂他汀组),建立动脉粥样硬化模型,人工饲养8周后检测各组小鼠血清一氧化氮(NO ) 、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)水平及行小鼠主动脉弓HE 染色。结果:(1)HE 染色结果显示:空白对照组主动脉内膜未见明显增厚,泡沫细
胞含量极少;高脂饮食组小鼠主动脉弓可见明显动脉粥样硬化斑块,内膜明显增厚,其内可见大量泡沫细胞及增生的纤维组织,胞体大,胞浆呈空泡状,纤维帽薄;高脂他汀组主动脉亦可见明显动脉粥样硬化斑块,内膜稍增厚,泡沫细胞含量极少,可见较厚纤维帽 。(2)普通饮食组、高脂饮食组、高脂他汀组血清NO 分别为(56.104±16.104) 、(29.881±12.009)、(53.713±16.430)μmol /L ,TNF -α分别为(3.138±0.435) 、(5.163±0.523) 、(3.938±0.452)pg /mL (P ＜0.05) 。结论:已知NO 及TNF -α与动脉粥样硬化相关,阿托伐他汀能够调节小鼠血清NO 、TNF -α的表达,提示阿托伐他汀能够通过调整炎性介质的表达发挥其抗动脉粥样硬化的作用 。
关键词
动脉粥样硬化;
阿托伐他汀;
血清NO ;
血清TNF -α
Effects of a torvastatin on the serum NO and TNF -αin A poE -/-mic e for a therosclerosis ZHANG Min *,NING Ya -yuan ,CHEN Li -juan ,WANG Jun -nan.*Department of Emergency Medicine ,The Second Hospital of Jilin University ,C hangchun 130041,China
Corresponding author :CHEN Li -juan E-mail :[email protected]
【Abstract 】Objective To investigate antiatherosclerotic mechanism of atorvastatin.Methods Twenty -four A poE -/-mice were randomly divided into three groups (n =8),and given normal diet ,high -fat diet ,high -fat diet add atorvastatin ,to establish atherosclerosis model.After 8weeks ,the serum level of NO ,TNF -αwere detected and aortic arch were stained by HE staining.Results (1)HE staining showed :In the control group ,aortic intima was non -thickened ,foam cell was poor.High -fat diet group showed obvious atherosclerotic plaque in aortic arch ,thickened intima ,a large number of foam cells ,hyperplastic fibrous tissue ,large soma ,cytoplasmic vacuole and thin fibrous cap.High -fat diet add atorvastatin group also showed significant atherosclerotic plaque ,slightly thickened intima ,few foam cells and thick fibrous cap.(2)The serum levels of NO in three groups were (56.104±16.104),(29.881±12.009),(53.713±16.430)μmol /L ,and TNF -αwere (3.138±0.435),(5.163±0.523),(3.938±0.452)pg /mL (P ＜0.05),respectively.Conclusion Atorvastatin can regulate the serum levels of NO and TNF -α,which are associated with atherosclerosis.It suggests that atorvastatin adjust the expression of inflammatory mediators and play an important role in anti -atherosclerosis.
【Key words 】Artherosclerosis ;Atorvastatin ;NO ;TNF -α
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18~22g 。由北京维通利华动物中心提供,SPF/ UAF级,许可证编号SCXK(京)2006-0008 。
1.2主要试剂NO试剂盒购自美国Cayman公司 。
TNF-αELISA试剂盒购自eBioscience公司 。阿托伐他汀钙片(立普妥),辉瑞制药有限公司。
1.3实验动物分组及模型制备A poE-/-小鼠24只,适应性喂养1周后随机分为3组:空白对照组 、高脂饮食组 、高脂他汀组(n=8),分别给予普通小鼠颗粒饮食、高脂饲料 、高脂饲料+阿托伐他汀[10mg/(kg·d)],均饲养8周。8周后小鼠摘眼球取血,标本离心,分离血清,测血清NO 、TNF-α。1.4血清NO测定通过测定血清中稳定的氧化代谢产物亚硝酸盐(NO
2
)水平表示NO产生情况。采用硝酸盐还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐,然后通过经典的Griess reagent检测亚硝酸盐,从而测定出NO水平。
1.5血清TNF-α测定采用ELISA试剂盒测定TNF-α水平,原理:夹心法酶联免疫吸附试验。检测相抗体经生物素标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经PBS的彻底洗涤后,用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化为蓝色,并在酸的作用下最终转化为黄色。颜色的深浅与样品中的TNF-α呈正相关。
1.6小鼠主动脉弓石蜡切片苏木素-伊红染色(HE染色)生理盐水20mL心脏灌流后取出心脏及主动脉,切取距主动脉根部0.5cm处的主动脉弓, 4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,行HE染色 。1.7统计学处理计量资料以x±s表示。组间两两比较用t检验及卡方检验,检验水准α=0.05 。所有数据用SPSS1
2.0软件进行处理。
2结果
2.1小鼠主动脉弓HE染色HE染色结果显示AS模型制备成功。空白对照组主动脉内膜未见明显增厚,泡沫细胞含量极少;高脂饮食组小鼠主动脉弓可见明显动脉粥样硬化斑块,内膜明显增厚,其内可见大量泡沫细胞及增生的纤维组织,胞体大,胞浆呈空泡状,纤维帽薄;高脂他汀组主动脉亦可见明显动脉粥样硬化斑块,内膜稍增厚,泡沫细胞含量极少,可见较厚纤维帽 。见图1。
注:a,空白对照组小鼠主动脉弓HE染色(×100);b,高脂饮食组小鼠主动脉弓HE染色(×100);c,高脂他汀组小鼠主动脉弓HE 染色(×100);d,空白对照组小鼠主动脉弓HE染色(×400);e,高脂饮食组小鼠主动脉弓HE染色(×400);f,高脂他汀组小鼠主动脉弓HE染色(×400)
图1小鼠主动脉弓HE 染色
a b c d
e f
2.2血清NO测定统计结果3组结果相比较,空
白对照组小鼠血清NO水平最高,高脂他汀组小鼠
血清NO水平居中,高脂饮食组小鼠血清NO水平最
低,空白对照组与高脂他汀组结果比较未见明显统
计学差异(P>0.05),而空白对照组和高脂他汀组
与高脂饮食组比较均具有统计学意义(P＜0.05)。见
表1 。
2.3TNF-α测定统计结果3组结果相比较,空白对照组小鼠血清TNF-α水平最低,高脂他汀组小鼠血清TNF-α水平居中,高脂饮食组小鼠血清TNF-α水平最高,3组组间比较均具有统计学意义(P＜0.05) 。见表1。3讨论
在AS病变发展过程中,机体常由于内皮功能障碍或受损,导致eNOS表达或活性下降,内源性NO生成减少,由此可导致内皮素释放增加,且斑块或增厚的管壁内滋养动脉对内皮素敏感性的异表13组小鼠血清NO及TNF-α水平比较x±s 组别
空白对照组
高脂饮食组
高脂他汀组
例数
8
8
8
NO(μmol/L)
56.104±16.104
29.881±12.009*
53.713±16.430#
TNF-α(pg/mL)
3.138±0.435
5.163±0.523*
3.938±0.452*#
注:与空白对照组相比,*P＜0.05;与高脂饮食组相比,#P＜0.05
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常升高,使血管持久收缩 、加剧管腔狭窄,引起心脑血管 、高血压病变 。亦有研究[1]显示冠心病患者血清中NO含量与正常对照组相比明显下降,故百年来临床应用硝酸酯类药物提供外源性NO治疗 、改善缺血性心脏病症状就是一个很好的证明 。本研究结果显示空白对照组及高脂他汀组小鼠血清NO含量比高脂饮食组显著增高,显示他汀类药物能够调整NO的表达,可能与其除降脂外的改善血管舒张功能、减少血管炎症和氧化应激损伤 、抑制血栓形成和血小板聚集、阻止血小板和白细胞向血管内皮的黏附、稳定粥样硬化易损斑块、促进心血管形成等功能有关[2]。综合现有基础实验及临床研究资料,高脂他汀组小鼠血清NO水平较高,分析可能与以下途径有关:(1)他汀类药物能显著降低低密度脂蛋白水平,降低了小窝蛋白-1(Cav-1)的合成,减少eNOS的磷酸化而促进NO的产生,从而改善血管功能[3]。(2)可通过降低内皮细胞内Cav-1的表达和削弱Cav-1与eNOS的相互作用,导致NO 的产生增多[4] 。(3)通过降低NADPH氧化酶的表达,抑制内皮细胞产生超氧阴离子,维持NO与自由基平衡发挥保护内皮作用[5] 。(4)须由eNOS介导发挥作用[6]。因此,他汀类药物上调内皮源性NO水平是其抗AS进展的多效性之一 。
研究显示高脂饮食组小鼠TNF-α水平较高,而许多研究[7]也表明冠心病患者中TNF-α水平也明显升高;高脂他汀组TNF-α水平较低,揭示可能与阿托伐他汀的抗炎作用有关。吴旭斌等[8]研究发现阿托伐他汀可明显减少急性冠脉综合征患者外周血单核细胞表达炎症因子TNF-α,且作用强度呈剂量依赖性,亦支持本研究的结果 。TNF-α可对血管内皮细胞直接产生细胞毒作用,促进中性粒细胞脱颗粒及氧化代谢,加速脂质过氧化,破坏内皮细胞结构和功能的完整性[9],而损伤血管内皮细胞进一步释放白细胞介素1 、巨噬细胞移动抑制因子 、血管细胞黏附分子-1 、细胞间黏附分子-1等的表达,促进单核细胞 、巨噬细胞等的黏附、聚集及血管内皮下迁移作用;还可刺激内皮细胞激活血小板激活因子,使体内凝血与抗凝血系统失平衡,导致损伤部位血栓的形成;间接促进MMPs的表达,增加细胞外基质的降解,从而导致斑块的不稳定性 。故TNF-α在AS的发生 、发展 、血栓形成及斑块破裂中起了重要作用,检测其血清表达水平可作为预测心脑血管事件的指标,降低其活性 、表达水平有利于抑制AS进程 。
另外,本实验对3组小鼠主动脉弓血管行HE 染色,结果比较可见高脂饮食组及高脂他汀组均可见明显动脉粥样硬化斑块,但后者所示内膜增厚 、泡沫细胞含量极少及较厚纤维帽,动脉粥样硬化斑块稳定,故动脉粥样硬化斑块形态结构上亦提示阿托伐他汀具有有效的抗动脉粥样硬化作用。已知NO及TNF-α与AS相关,本研究通过检测3组小鼠血清NO水平、TNF-α的水平,显示高脂他汀组较高脂饮食组小鼠血清NO水平增高, TNF-α含量降低,故提示阿托伐他汀能够调整血清NO 、TNF-α的表达而发挥其抗AS机制,但其具体信号传导途径尚需进一步研究 。
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(收稿:2011-07-11编辑:王耀东)
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