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时间:2020-06-03 22:46  编辑:迁西科教局

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中国生物制品学杂志Chin J Biologicals

慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia ,CML )是一种造血干细胞恶性克隆性疾病,在基因水平上的异常表现为Ph 染色体t (9;22)(q34;q11)的产生,其编码的BCR /ABL 融合蛋白具有高酪氨酸激酶

活性,在肿瘤的发生中起重要作用[1]。

寡聚化结构域(Oligomerization domain ,OD )是BCR /ABL 融合蛋白重要的结构域,可促使BCR 蛋白寡聚化,进而激活ABL 蛋白的酪氨酸激酶活性[2⁃3]。本课题组前期针对该位点设计的CTP ⁃OD ⁃HA 融合蛋白可抑制OD 域介导的寡聚化,进而抑制BCR /ABL

TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 融合蛋白的原核表达及纯化

肖恒,王海霞,陶崑,钟梁,黄世峰,祖白玲,冯文莉

重庆医科大学临床血液学教研室,重庆400016

摘要:目的构建pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化融合蛋白。方法以前期构建的质粒p32a (+)CTP ⁃OD ⁃HA 为模板,PCR 扩增寡聚化结构域(Oligomerization domain ,OD )中起关键作用的OD 2基因序列,与

胞浆转导肽(Cytoplasmic transduction peptide ,CTP )和流感病毒血凝素抗原表位(Hemagglutinin ,HA )连接后,克隆至pCold ⁃TF ⁃DNA 质粒中,构建质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA ,同时构建质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 作为对照。将两种质粒分别转

化E.coli BL21(DE3),IPTG 诱导表达,表达的融合蛋白经Ni ⁃NTA 亲和层析纯化后,进行SDS ⁃PAGE 和Western blot 鉴定。结果质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 和pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 经PCR 、双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 和TF ⁃CTP ⁃HA 相对分子质量分别约为63000和58000,两种融合蛋白均主要存在于破菌上清中,表达量分别约占菌体总蛋白的32%和25%,破菌沉淀中有少量表达;纯化的融合蛋白纯度均达95%以上,均可与鼠抗HA ⁃tag 多克隆抗体特异性结合。结论成功构建了pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 原核表达质粒,在大肠杆菌中表达并纯化了融

合蛋白,为后续研究其在CML 中的作用机制奠定了基础。

关键词:慢性粒细胞白血病;寡聚化结构域;融合蛋白;表达;纯化中图分类号:Q784文献标识码:A 文章编号:1004⁃5503

Prokaryotic expression and purification of TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA

fusion protein

XIAO Heng ,WANG Hai ⁃xia ,TAO Kun ,ZHONG Liang ,HUANG Shi ⁃feng ,ZU Bai ⁃ling ,FENG Wen ⁃li

Department of Clinical Hematology ,Chongqing Medical University ,Chongqing 400016,China

Corresponding author:FENG Wen ⁃li ,E ⁃mail:[email protected]

Abstract :Objective To construct prokaryotic expression vector pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA ,express TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA fusion

protein in E.coli and purify the expressed product.Methods Gene fragment OD 2,the key section of gene encoding

oligomerization domain (OD ),was amplified by PCR using previously constructed plasmid p32a (+)CTP ⁃OD ⁃HA as a template ,and linked to cytoplasmic transduction peptide (CTP )and hemagglutinin (HA )antigenic epitope of influenza virus ,then cloned into prokaryotic expression vector pCold ⁃TF ⁃DNA to construct recombinant plasmid pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA.Meanwhile ,

recombinant plasmid pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA was constructed as control.Plasmids pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA and pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA were transformed to E.coli BL21for expression under induction of IPTG.The expressed fusion protein was purified by Ni ⁃NTA affinity chromatography ,and identified by SDS ⁃PAGE and Western blot.Results PCR ,restriction analysis and sequencing proved that recombinant plasmids pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA and pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA were constructed correctly.The expressed fusion proteins TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA and TF ⁃CTP ⁃HA ,with relative molecular masses of about 63000and 58000,

mainly existed in the supernatant ,a few of which were in precipitate of lysate of E.coli ,and contained 32%and 25%of total somatic proteins ,respectively.Both the fusion proteins reached purities of more than 95%after purification ,and

showed specific bindings to mouse polyclonal antibody against HA ⁃tag.Conclusion Prokaryotic expression vector pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA was constructed successfully ,and fusion protein TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA was expressed in E.coli and purified ,

which laid a foundation of further study on action mechanism of the fusion protein in chronic myeloid leukemia (CML ).Key words :Chronic myeloid leukemia (CML );Oligomerization domain (OD );Fusion protein ;Expression ;Purification

基金项目:国家自然科学基金资助项目(30670901).通讯作者:冯文莉,E ⁃mail :[email protected]

·基础研究·

1

·

·

网络出版时间:2013-05-08 14:00

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1197.Q.20130508.1400.001.html

中国生物制品学杂志Chin J Biologicals

的激酶活性,但因其相对分子质量较大,

影响了其作用的发挥[4]。本实验在此基础上,进一步构建含该OD 域中起关键作用的OD 2基因序列的原核表达质粒,表达并纯化融合蛋白,为后续研究其在CML 中的作用机制奠定基础。1材料与方法

1.1菌株及质粒质粒p32a (+)CTP ⁃OD ⁃HA 为本课题组前期构建;感受态大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)和质粒pCold ⁃TF ⁃DNA 由重庆医科大学临床检验诊

TGGAG 下游:CCGGAATTCCGGCAGCAACGTCTGCAGGT ⁃

AGATCAT

CTP 上游:CCGCTCGAGTACGGACGCCGCGCACGCC ⁃

193

GCCGCCGCCGCCGCG 下游:CCCAAGCTTCTAAGCGTAGTCTGGGACGT ⁃

CGTATGGGTAG

HA 正义:pAATTCTACCCATACGACGTCCCAGACTA ⁃

36

CGCTTAG 反义:pAGCTTCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGT ⁃

ATGGGTAG

1.4pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 和pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 质粒的构建以质粒p32a (+)CTP ⁃OD ⁃HA 为模板,PCR 扩增OD 2基因,反应条件为:98℃预变性1min ;

98℃10s ,65℃10s ,72℃20s ,共30个循环;72℃再延伸5min 。1%琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR 产物,与CTP ⁃OD ⁃HA (p32a ⁃CTP ⁃OD ⁃HA 经CTP 引物扩增所得产物)分别经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,回收

OD 2基因、

CTP 和HA 基因,以T4DNA 连接酶于16℃连接10h ,获得CTP ⁃OD 2⁃HA 片段。用Xho Ⅰ和Hind Ⅲ分别双酶切CTP ⁃OD 2⁃HA 片段和pCold ⁃TF ⁃DNA 载体,回收目的基因片段和载体片段,以T4DNA 连接酶16℃连接10h ,连接产物即为pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 。

将等质量的HA 正反义引物混合后,于PCR 仪℃5min ;37℃建的pCold ⁃TF ⁃

酶切,

电泳回收T4DNA 连接

⁃TF ⁃CTP ⁃HA ,

受态大肠杆菌μg /ml ),37℃

ml 氨苄抗性LB 菌液,进行菌落

8ml 氨苄抗。用质粒小⁃OD 2⁃HA 、pCold ⁃PCR 扩增,反应40s ,61℃10s ,5min 。PCR 产Xho Ⅰ和Hind Ⅲ,⁃HA 和pCold ⁃TF ⁃琼脂糖凝胶电泳鉴定为阳性的质

,

测序引物为1.5目的基因的诱导表达将鉴定正确的重组质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 和pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 分别转化入感受态大肠杆菌BL21(DE3),涂布含100μg /ml 氨苄西林的LB 平板上过夜生长,挑取多克隆菌落,接

种于5ml 氨苄抗性LB 培养基中,

待菌液A 600值为0.5左右时,加入终浓度为0.2mmol /L 的IPTG 10μl ,15℃振荡诱导过夜,4℃条件下12000r /min 离心收集菌体,超声裂解,4℃条件下16000×g 离心,分

别取诱导后的菌液、破菌上清和沉淀,进行10%SDS ⁃

PAGE 分析。

1.6表达产物的纯化诱导表达的重组菌裂解上清经Ni ⁃NTA 亲和层析纯化,分别用漂洗液1(10mmol /L

·

中国生物制品学杂志Chin J Biologicals

咪唑,500mmol /L NaCl ,20mmol /L Tris 溶液)、漂洗液2(25mmol /L 咪唑,500mmol /L NaCl ,20mmol /L Tris 溶液)漂洗后,再用洗脱液(500mmol /L 咪唑,

500mmol /L NaCl ,20mmol /L Tris 溶液)洗脱,收集洗脱液,进行10%SDS ⁃PAGE 分析,考马斯亮蓝染色。

1.7纯化产物的Western blot 鉴定纯化的融合蛋白经10%SDS ⁃PAGE 分离后,转移至硝酸纤维素膜上,以含5%脱脂奶粉的TBST 封闭液室温封闭6h ;加入鼠抗HA ⁃tag 多克隆抗体(1:1000稀释),4℃孵育过夜;再加入HRP 标记的羊抗鼠IgG (1:1000稀释),室温孵育1h ;化学发光显影。2结果

2.1pCold ⁃TF ⁃

CTP ⁃OD 2⁃HA 和pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 质粒的鉴定

2.1.1PCR 鉴定1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 的PCR 产物可见193bp 的特异性条带(图1);质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 的PCR 产物可见90bp 的特异性条带(图2),大小分别与CTP ⁃OD 2⁃HA 和CTP ⁃HA 片段一致。

M :DNA marker DL2000;1~4:CTP ⁃OD 2⁃HA 的PCR 产物。

图1pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 质粒的PCR 产物电泳图

Fig 1.Electrophoretic profile of PCR product of plasmid

pC ⁃old ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA

M :DNA marker DL2000;1:OD PCR 产物对照;2~4:CTP ⁃HA 的

PCR 产物。

图2pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 质粒的PCR 产物电泳图

Fig 2.Electrophoretic profile of PCR product of plasmid pC ⁃

old ⁃TF ⁃CTP ⁃HA

2.1.2双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳分析显示,

pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 阳性质粒经Xho Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,分别可见5769bp 的载体条带和193bp 的目的基因条带,见图3;pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 阳性质粒经Xho Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,分别可见5769bp 的载体条带和90bp 的目的基因条带(条带较浅),见图4。

M :DNA marker DL2000;1~3:质粒的双酶切产物(1号泳道为阳

性质粒);4~6:未酶切的质粒。

图3重组质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃OD 2⁃HA 的双酶切(Xho Ⅰ/

Hind Ⅲ)鉴定

Fig 3.Restriction map of recombinant plasmid pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃

OD 2⁃HA (Xho Ⅰ/Hind Ⅲ)

M :DNA marker DL2000;1~3:未酶切的质粒;4~6:质粒的双酶

切产物。

图4重组质粒pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃HA 的双酶切(Xho Ⅰ/Hind Ⅲ)鉴定

Fig 4.Restriction map of recombinant plasmid pCold ⁃TF ⁃CTP ⁃

HA (Xho Ⅰ/Hind Ⅲ)

2.1.3测序鉴定重组质粒测序结果均与目的序

列完全相同,通过BLAST 软件与GenBank 中的序列进行比对,结果显示同源性为100%,表明重组质粒构建正确。

2.2表达产物的鉴定10%SDS ⁃PAGE 分析显示,在相对分子质量约63000和58000处分别可见TF ⁃

CTP ⁃OD 2⁃HA 和TF ⁃CTP ⁃HA 融合蛋白条带,

两种融合蛋白均主要存在于破菌上清中,表达量分别约占菌体总蛋白的32%和25%,破菌沉淀中有少量表达,见图5。

193

bp M

12

3

45

6bp

2000

1000750500250100

5769bp M

1

2

3

4bp

2000

1000750500250100

90

。

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