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YAT-006

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YAT-006

中国组织工程研究 第 21卷 第 13期 2017– 05– 08出版

Chinese Journal of Tissue Engineering Research May 8, 2017 Vol.21, No.13

P .O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 2062

·研究原著·

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史光军,男, 1966年生, 山东省潍坊市人,汉族, 2005年华中科技大学同 济医学院毕业,博士,主 任医师,硕士生导师,主 要从事肝胆胰脾疾病与干 细胞的研究。

通讯作者:许评,主任医 师,教授,博士后导师, 青 岛 市 市 立 医 院 肝 胆 外 科,山东省青岛市 266000

中图分类号 :R394.2 文献标识码 :B 文章编号 :2095-4344 (2017)13-02062-06 稿件接受:2016-12-11

Shi Guang-jun, M.D., Chief physician, Master’ s supervisor, Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Corresponding author: Xu Ping, Chief physician, Professor, Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China

PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及 移植治疗 1型糖尿病

史光军 1,白国立 2,谭雪莹 1,朱继军 2,许 评 1(1青岛市市立医院肝胆外科,山东省青岛市 266000; 2青岛大学医学院,山东省青岛市 266000)

引用本文 :史光军,白国立,谭雪莹,朱继军,许评 . PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗 1型糖尿病 [J].中国组织工程研究, 2017, 21(13):2062-2067.

DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.13.016 ORCID: 0000-0002-6926-2354(史光军 )

文章快速阅读:

文题释义:

胰十二指肠同源盒基因 1:为一种在胰腺发育中起重要作用的特异性转录因子,对于胰腺的早期发育及晚期 的增生分化均发挥着重要作用,并且对维持胰腺 β细胞的功能也有重要作用。

腺病毒 (Adenovirus, Ad) :是一种无包膜的线状双链 DNA 病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒 拥有近 50 个血清型,大多数腺病毒载体都是基于血清型 2和血清型 5,通过转基因的方式取代 E1和 E3基 因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达 E1和 E3基因的细胞中复制,因此是一种适用于治 疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具,功能强大并易于操作。

摘要

背景:近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向分化潜能,在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用。 目的:观察 PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。 方法:采用腺病毒转染方法将 PDX-1基因转入人脂肪间充质干细胞,双硫腙染色鉴定细胞分化情况, ELISA 法检测细胞胰岛素分泌水平。从 20只雄性 SD 大鼠中随机取 4只作为对照组,注射生理盐水,其余 16只按 65 mg/kg 的剂量注射链脲霉素建立糖尿病模型,再随机等分为移植组和糖尿病组,移植组大鼠尾静脉注射 PDX-1基因转染脂肪间充质干细胞。

结果与结论:①转染后 15 d,转染组胰岛素阳性细胞数量、胰岛素分泌量均高于未转染组 (P < 0.05);②移植 组大鼠空腹血糖水平显著下降 (P < 0.05),体质量明显增加 (P < 0.05),而糖尿病大鼠空腹血糖维持在较高水 平,且体质量显著下降;③结果提示,导入 PDX-1基因对人脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作 用, PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植能有效治疗大鼠糖尿病,但具体机制尚待进一步研究。 关键词:

干细胞;移植;脂肪间充质干细胞;胰十二指肠同源盒基因 1;腺病毒;基因转染;胰岛样细胞;糖尿病; 血糖;体质量 主题词:

脂肪组织;间质干细胞移植;基因 , 同源盒;糖尿病;组织工程 基金资助:

山东省医药卫生科技发展计划 (2014WS0217)

PDX-1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: differentiation into islet-like cells and treatment of type 1 diabetes via cell transplantation

Shi Guang-jun1

, Bai Guo-li2

, Tan Xue-ying1

, Zhu Ji-jun2

, Xu Ping1 (1

Department of Hepatobiliary Surgery, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao 266000, Shandong Province, China; 2Qingdao University Medical College, Qingdao 266000, Shandong Province, China)

Abstract

BACKGROUND: Recent studies have shown that adipose-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) not

史光军,等 . PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗 1型糖尿病 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

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only have multilineage differentiation potential, but also exert an important role in blood sugar balance and hormone production.

OBJECTIVE: To observe the differentiation potential of human ADMSCs (hADMSCs) into functional islet-like cells and the therapeutic effect of hADMSCs transplantation in diabetic rats.

METHODS: PDX-1 gene was transfected into hADMSCs by adenovirus. Cell differentiation and insulin secretion were identified and detected by dithizone staining and ELISA, respectively. Twenty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into control group (n =4), diabetes group (n =8) and transplantation group (n =8). Rats in the latter two groups were subjected to making diabetic models by 65 mg/kg streptozotocin injection. Afterwards, rats in the transplantation group were given PDX-1 transfected ADMSCs via the tail vein.

RESULTS AND CONCLUSION: At 15 days after transfection, the number of insulin positive cells and insulin secretion were both increased significantly (P < 0.05). Fasting glucose levels in the transplantation group decreased significantly (P < 0.05), while the body weight increased significantly (P < 0.05). In the diabetic group, the fasting glucose level still maintained at a high level, and the body weight of rats was significantly decreased. These results implicated that PDX-1 gene could induce hADMSCs differentiating into functional islet-like cells. PDX-1 transfected ADMSCs transplantation is effective in treating diabetic rats, but the mechanism needs further study.

Subject headings: Adipose Tissue; Mesenchymal Stem Cell Transplantation; Genes, Homeobox; Diabetes Mellitus; Tissue Engineering

Funding: the Medicine & Health Development Plan of Shandong Province, No. 2014WS0217

Cite this article: Shi GJ, Bai GL, Tan XY, Zhu JJ, Xu P. PDX-1 transfected human adipose-derived mesenchymal stem cells: differentiation into islet-like cells and treatment of type 1 diabetes via cell transplantation. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2017;21(13):2062-2067.

0 引言 Introduction

对 1型糖尿病患者来说,胰岛移植是目前很好的替代 治疗方法之一, 胰岛移植具有相对安全、 不良反应少等优 势 [1]。虽然最近几年,临床胰岛移植研究取得了突破性的 进展,但人们在移植部位、能否脱离外源性胰岛素控制和 提高移植胰岛细胞的存活率等方面仍然面临着种种问题。 近几年来,利用干细胞移植技术来克服胰岛短缺的问题成 为人们研究的焦点,将具有某种特定功能的细胞移植到体 内相应的受损部位,不仅避免了传统药物治疗引起的毒副 作用,而且可以恢复受损器官部分功能 [2]。

脂肪间充质干细胞与骨髓间充质干细胞拥有相类似的 细胞表型, 均为 CD73+、 CD90+、 CD105+、 CD45-、 CD34-[3]

。

脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能,在特定的诱导培养 条件下可向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞及神经细胞等 组织细胞定向分化,甚至可将其定向诱导为心肌细胞、角 膜细胞等 [4-5],而且脂肪组织来源丰富,可反复取材,较少 涉及医学伦理学问题 [6]。

PDX-1即 胰十 二指 肠同 源 盒基 因 1(pancreatic and duodenal homeobox factor-1, PDX-1), 作为一种在胰腺发 育中起重要作用的特异性转录因子,对于胰腺的早期发育 及晚期的增生分化均发挥着重要作用,并且对维持胰腺 β细胞的功能也有着重要作用。 PDX-1能调节与胰岛 β细胞功 能相关的基因表达,将 PDX-1基因转染某些非胰岛 β细胞 (如骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、肝细胞 ) 后, 这些细胞均可以产生胰岛素 [7-8]。通过转染 PDX-1基因促进 人脂肪间充质干细胞转化的研究尚未有报道。干细胞对降 低血糖、 改善临床症状及并发症已取得较好的疗效。 目前, 医学界对脂肪间充质干细胞应用于糖尿病治疗工作尚处于 探索阶段,有不少问题尚需进一步解决。实验观察 PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞的分化能力及

移植治疗糖尿病的效果。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞 -基因学体外实验及随机对照动物实验。 1.2 时间及地点 于 2015年 1至 12月在青岛市市立医院 卫生部细胞移植实验室完成。 1.3 材料

1.3.1 动物 清洁级雄性 SD 大鼠 20只, 4周龄,体质量为 160-180 g ,购自青岛市即墨动物中心。将动物置于 18- 25 ℃、 12-12 h昼夜循环光照条件下喂养,自由摄食与饮 水,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学委员会制订 的标准。

1.3.2 脂肪组织 脂肪来源于青岛市市立医院肝胆外科 35-50岁胆石症 (无其他合并疾病 ) 肥胖女性择期开腹手术 患者,患者及家属均知情同意,研究通过院内伦理委员会 批准。

1.3.3 主要试剂和仪器 Ⅰ型胶原酶、双硫腙、链脲佐菌 素 (美国 Sigma 公司 ) ; DMEM/F12、 DMEM -低糖和 DMEM -高糖培养液 (美国 HyClone 公司 ) ;胎牛血清 (美国 Gibco 公 司 ) ; 40 g/L多聚甲醛、 Triton X-100、胰蛋白酶抑制剂 (北 京 Solarbio 公司 ) ; 胰蛋白酶、 4’ , 6-二脒基 -2-苯基吲哚 (江 苏碧云天生物科技研究所 ) ; 人胰岛素 ELISA 检测试剂盒 (武 汉博士德生物公司 ) ; 兔抗人 CD29, CD73, CD49d , CD90, CD14, CD45, CD34, HLA-DR , PDX-1抗体 (北京博奥 森生物技术有限公司 ) ;二氧化碳培养箱 (美国 Thermo 公 司 ) ;倒置相差显微镜 (日本 Nikon 公司 ) ;流式细胞仪 (美国 BectonDickinson 公司 ) ;荧光显微镜及彩色照相系统 (上海 豫光仪器有限公司 ) ;酶标仪 (美国 Thermo 公司 ) 。 1.4 实验方法

1.4.1 脂肪间充质干细胞的培养 实验用脂肪取自肝胆

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外科手术患者,无菌条件获得腹部脂肪组织,在含双抗的 1×PBS 中浸泡 5 min并清洗 5次,然后用无菌眼科剪剔除筋 膜及小血管,剪碎至糊状,移入 50 mL离心管内,加入 2倍 于脂肪组织体积的 0.15%Ⅰ型胶原酶, 37 ℃水浴振荡消化 45 min, 待管内液体消化至均匀乳白色液体时, 1 500 r/min离心 10 min ,去除上层未消化的脂肪组织,加入等体积 DMEM/F12培养液 (含体积分数为 10%胎牛血清 ) 终止消化 并混匀, 无菌 200目细胞筛网过滤, 滤液在室温条件下再次 离心 (1 500 r/min 10 min) ,弃去上层杂质,底层沉淀用 DMEM/F12培养液 (含体积分数为 10%胎牛血清 ) 重悬后,接 种于 25 cm2细胞培养瓶, 放入细胞培养箱 (37 ℃, 体积分数 为 15%CO2) 中培养。待 24-36 h 后,在倒置显微镜下观察 细胞生长情况, 细胞生长达到 80%-90%融合时, 用胰蛋白 酶消化法按 1︰ 2比例进行细胞传代。细胞传代过程中,倒 置显微镜下观察细胞生长情况并记录。

1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定 使用 CD29, CD73, CD49d , CD90为脂肪干细胞的阳性指标, CD14, CD45, CD34, HLA-DR 为阴性指标单抗标记脂肪间充质干细胞, 流式细胞仪检测其纯度。脂肪间充质干细胞成脂肪诱导 2周后对其进行油红 O 染色, 成骨诱导 2周后对其进行碱性磷 酸酶染色。

1.4.3 携带 PDX-1基因的腺病毒制备 携带 PDX-1基因的 腺 病 毒 由 山 东 维 真 生 物 科 技 有 限 公 司 暨 美 国 ViGene Biosciences 公司中国办事处合成:pdx-1基因由 NM 00029基因序列克隆至 pAD-Amp 载体,腺病毒对其包装,载体 C 端带有 His , Flag 标签。 研究选用的腺病毒载体为人类血清 5型腺病毒。

1.4.4 重组腺病毒对脂肪间充质干细胞的转染 将状态 良好的第 3代脂肪间充质干细胞接种到 6孔板,保证第 2天 进行病毒感染的时候细胞汇合率介于 50%-70%之间。 感染 前,吸去细胞原有培养基,加入完全培养基,将病毒液按 MOI=50加入细胞中, 轻轻混匀后放入培养箱, 培养 4 h后吸 去含病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续 37 ℃培 养 48 h, 收获感染后细胞通过 Western blot和免疫荧光法来 检测转染 PDX-1基因的表达。

1.4.5 Western blot 检测转染细胞 PDX-1的表达 留取转 染组、 未转染组贴壁生长的细胞应用 PBS 冲洗 2次, 将细胞 移至 EP 管中, 1 500 r/min离心 5 min ,弃上清液,加入蛋 白裂解液裂解细胞,取 50 μL 蛋白液与 10 μL 5×上样缓冲 液混合, 100 ℃变性 10 min(以上每步均在冰袋上操作 ) 。 提 取蛋白样品, 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳, 转至 PVDF 膜, 5%脱脂奶粉封闭,兔抗人单克隆抗体作为一抗 (1︰ 800) 孵育 4 ℃过夜,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG 作为二抗 (1︰ 1 000)孵育 2 h,化学曝光显影, β-actin 做内参,测定 转染后 PDX-1的表达。

1.4.6 免疫荧光染色方 法检测转染细胞 PDX-1的表达 首先用 40 g/L多聚甲醛室温固定细胞 20 min ,然后用

1%TritonX-100穿透细胞 45 min, 再用 5%BSA封闭 40 min; 滴加兔抗人的 PDX-1单克隆抗体 (1︰ 400) , 4 ℃过夜;滴 加 FITC 标记荧光抗体 (山羊抗兔, 1︰ 200) ,避光室温孵育 1.5 h;每步操作前均用 1×PBS 冲洗 3遍, 10 min/次。将细 胞置于荧光显微镜下,相应荧光激发,观察细胞染色情况 并记录。

1.4.7 双硫腙 (DTZ)染色 将转染诱导后 15 d 的细胞用 D-Hank’s 缓冲液冲洗 2遍,加入 1 mL D-Hank’s 缓冲液及 10 μL双硫腙贮存液, 37 ℃孵育 30 min,于倒置显微镜下 观察细胞着色情况并记录。

1.4.8 ELISA 法检测细胞胰岛素分泌水平 细胞转染诱导 结束后 15 d, 用 1×PBS 缓慢冲洗 2遍, 先用浓度 5.5 mmol/L低糖 DMEM 培养基, 37 ℃温箱孵育 1 h,吸出培养液备用; 1×PBS 缓 慢 冲 洗 2次 , 再 加 入 浓 度 25.0 mmol/L高 糖 DMEM 培养基, 37 ℃温箱孵育 1 h ,吸出培养液备用。取 细胞培养液,用 ELISA 法测定培养液中的胰岛素含量。 1.4.9 实验动物分组 20只 SD 大鼠中取 4只作为对照 组,其余 16只建立糖尿病模型。造模成功后,大鼠随机 等分为移植组和糖尿病组,移植组大鼠移植脂肪间充质 干细胞。

1.4.10 糖尿病大鼠模型的建立 大鼠禁食 24 h,一次性腹 腔注射溶于枸橼酸缓冲液 (pH 4.0)的链脲佐菌素 (65 mg/kg), 48 h后测量随机血糖, 血糖浓度超过 16.8 mmol/L时为糖尿 病模型制备成功。

1.4.11 脂肪间充质干细胞移植 移植组大鼠造模成功后 立即通过尾静脉注入 1 mL 转染诱导后脂肪间充质干细胞 (细胞浓度为 1.5×109 L-

1) , 移植后定时测量大鼠空腹血糖及

体质量。

1.5 主要观察指标 ①脂肪间充质干细胞的培养与鉴定 结果; ② Western blot和荧光显微镜观察转染后细胞 PDX-1基因表达;③双硫腙染色结果;④ ELISA 法检测细胞胰岛 素分泌水平;⑤移植后大鼠血糖及体质量的变化。 1.6 统计学分析 实验数据使用 SPSS 19.0统计软件进 行统计学分析,数据以 x _

±s 表示,两组间比较采用 t 检验, P < 0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results

2.1 脂肪间充质干细胞的培养与鉴定结果 接种 24 h 之 后换液去除非贴壁细胞;两三天可见细胞形态改变,较均 一,成纤维细胞样生长,细胞生长有极性,融合后呈螺旋 状 (图 1) 。

流式细胞术检测脂肪间充质干细胞高表达分子表型 CD29, CD73, CD49d , CD90,低表达分子表型 CD14, CD45, CD34, HLA-DR(图 2) 。脂肪间充质干细胞成脂肪 诱导 2周后油红 O 染色阳性,证明其成脂分化能力 (图 3A ) ; 脂肪间充质干细胞成骨诱导 2周后碱性磷酸酶染色呈强阳 性反应,证明其成骨分化能力 (图 3B ) 。

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2.2 转染后细胞 PDX-1的表达 脂肪间充质干细胞在感 染 PDX-1 48 h 后 Western blot 法和免疫荧光法均可检测到 PDX-1的表达,对照组无 PDX-1的表达,且病毒感染后 15 d,仍能检测到 PDX-1的表达 (图 4, 5) 。

2.3 双硫腙染色结果 对转染后细胞进行双硫腙染色, 对 照组未出现胰岛素阳性细胞,实验组出现双硫腙阳性细胞 且被染成棕红色 (图 6) 。

2.4 细胞胰岛素分泌水平 转染组和对照组细胞在低糖 环境下分泌的胰岛素量差异无显著性意义 (P > 0.05), 而在 高糖环境下分泌的胰岛素量两组之间差异有显著性意义 (P < 0.05), 对照组细胞在刺激前后分泌的胰岛素量差异无 显著性意义 (表 1) 。

2.5 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠空 腹血糖的影响 大鼠注射链脲佐菌素 48 h 后,与对照组相 比,模型组大鼠空腹血糖明显增加 (P < 0.05),且明显高于

正常值; 给药后 2周, 大鼠空腹血糖仍维持在较高水平, 且 高于对照组 (P < 0.05),见 表 2。糖尿病大鼠细胞移植后空 腹血糖逐渐下降, 14 d 时空腹血糖水平明显低于糖尿病组 (P < 0.05)。糖尿病组大鼠空腹血糖维持较高水平,未见明 显变化,见 表 3。

2.6 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体 质量的影响 细胞移植后,移植组大鼠体质量逐渐增加, 14 d时大鼠体质量明显高于糖尿病组 (P < 0.05), 而糖尿病 组大鼠体质量持续下降,见 表 4。

图 1 第 3代人脂肪间充质干细胞 (×200)

Figure 1 Passage 3 human adipose-derived mesenchymal stem cells (×200)

图 4 转染后 2 d脂肪间充质干细胞 PDX-1免疫荧光染色 (×200) Figure 4 PDX-1

immunofluorescence staining of adipose-derived mesenchymal stem cells 2 days after transfection (×200)

A B

图 3 脂肪间充质干细胞成脂成骨诱导分化能力

Figure 3 Adipogenic and osteogenic differentiation potentials of human adipose-derived mesenchymal stem cells

图注:图中 A 为脂肪间充质干细胞成脂肪诱导 2周后油红 O 染色阳 性, 证明其成脂分化能力; B 为脂肪间充质干细胞成骨诱导 2周后碱 性磷酸酶染色呈强阳性反应,证明其成骨分化能力。

图 2 脂肪间充质干细胞流式细胞 仪鉴定结果

Figure 2 Flow cytometry detection of human

adipose-derived mesenchymal stem cells

图注:流式细胞术检测脂肪间充质 干细胞高表达分子表型 CD29, CD73, CD49d , CD90,低表达分 子 表 型 CD14, CD45, CD34,

HLA-DR 。

β-actin PDX-1

1 2

3

图 5 Western blot法检测转染后脂肪间充质干细胞中 PDX-1的表达 Figure 5 Western blot detection of PDX-1 expression in transfected adipose-derived mesenchymal stem cells 图注:1:PDX-1转染后 2 d; 2:PDX-1转染后 15 d; 3:对照组。 图 6 转染后 15 d漂浮的胰岛样细胞双硫腙染色呈阳性 (×400)

Figure 6 Floating islet-like cells positive for dithizone staining at 15 days after transfection (×400)

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3 讨论 Discussion

1型糖尿病主要是由于胰岛 β细胞被破坏导致胰岛素绝 对缺乏引起 [9-10]。研究表明, 1型糖尿病发病机制为自身体 内的 CD4+和 CD8+T 淋巴细胞共同参与自身抗原耐受破坏, 引起选择性胰岛细胞破坏和功能衰竭,最终导致胰岛素分 泌不足,引起糖尿病症状。胰岛素治疗已成为治疗当前 1型糖尿病的主要方式,虽然它能稳定患者的血糖状态改善 生活质量,但并不能延缓糖尿病并发症的发生。所以, 1型糖尿病的细胞替代治疗方法越来越受到重视。

脂肪间充质干细胞因含量丰富, 易于分离, 而受到广 泛关注 [11]。近年研究发现脂肪间充质干细胞不仅具有多向 分化潜能, 在血糖平衡及激素产生方面也具有重要作用 [12], 在治疗糖尿病方面的研究也越来越多。有报道显示脂肪间

充质干细胞与骨髓间充质干细胞相比能更好的被诱导为胰 岛样细胞 [13],是胰岛素分泌细胞来源的理想选择。实验选 择Ⅰ型胶原酶消化法,成功从脂肪中获取高纯度的脂肪间 充质干细胞。 PDX-1基因是胰腺发育和胰腺前体细胞分化 为 β细胞的主要调控因子, 胚胎发育早期, PDX-1在内分泌 细胞和外分泌细胞中均有表达,其能诱导内胚层向胰腺定 向发育和成熟, 活化后可促进 β细胞中重要基因的表达以及 维持 β细胞的正常功能, 随着胰腺的发育, PDX-1最终仅限 于在 β细胞内表达 [14-16]。 干细胞分化为胰岛素细胞的原理是 启动干细胞 PDX-1基因的表达 [17],从而表达更多胰岛细胞 特异性基因,使干细胞功能和形态发生改变 [18]。已有研究 显示,小鼠脂肪干细胞过表达 PDX-1,能够诱导其表达出 胰腺特定转录因子 Ngn3、 Nkx2-2、 insulin 1[19-21]。

重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具,首先,它 能够感染包括分裂、 非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞; 第二,病毒滴度高;第三,高滴度的病毒可获得高感染率 和高表达量;第四,病毒进入细胞后,病毒基因组不整合 到细胞染色体上。由于腺病毒的独特特征而倍受研究者喜 爱。在实验操作过程中,也需要更多的预防措施,以保证腺 病毒的安全性和转染效率。研究采用最广泛的复制缺陷型的 人类血清 5型腺病毒。用携带 PDX-1基因的腺病毒感染脂肪 间充质干细胞 48 h 后,通过 Western blot 和免疫荧光法证实 腺病毒对脂肪间充质干细胞具有很高的感染能力。胰岛细胞 中含有丰富的锌离子,而双硫腙是一种锌鏊合剂,所以是鉴 定胰岛细胞的特异性染色方法。转染后 15 d细胞在倒置显微 镜下可见胰岛样细胞团,用双硫腙染色呈棕红色。 ELISA 法 结果提示转染 PDX-1后脂肪间充质干细胞分化为胰岛素阳 性细胞的比例明显增高,提示 PDX-1能显著促进脂肪间充质 干细胞体外分化为胰岛样细胞,与 Grapin-Botton 等 [22]和 Feber 等 [23-25]分别利用 PDX-1基因诱导肝细胞、小肠上皮细 胞及脂肪间充质干细胞分化为胰岛样细胞的结果相似。

有研究显示,给予糖尿病患者移植干细胞可有效改善 糖尿病末期患者肾脏功能,提高患者存活率 [26-27]。大鼠注 射链脲霉素 48 h 后与对照组相比,模型组大鼠空腹血糖明 显增加,故大鼠造模成功,移植组大鼠给予 PDX-1转染脂 肪间充质干细胞, 大鼠空腹血糖逐渐下降, 2周时空腹血糖 水平仍明显低于糖尿病组。而糖尿病组大鼠空腹血糖维持 较高水平,无明显变化。移植 PDX-1转染脂肪间充质干细 胞的大鼠体质量逐渐增加, 2周时大鼠体质量明显高于糖尿 病组,而糖尿病组大鼠体质量持续下降。实验结果提示 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植可以有效降低糖尿病大 鼠血糖,这对人类应用脂肪间充质干细胞治疗糖尿病而言 具有重要借鉴意义。但是腺病毒携带 PDX-1转染脂肪间充 质干细胞在大鼠体内定位情况、对大鼠的毒副作用以及治 疗糖尿病的分子机制尚需进一步实验证实。

综上所述,人类脂肪组织来源的间充质干细胞容易获 得,通过腺病毒携带 PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞

表 1 葡萄糖刺激诱导后各组细胞胰岛素分泌量 (x _

±s , n =12, μg/L) Table 1 Insulin secretion in each group after glucose stimulation 表注:在高糖环境下,与对照组相比, a P < 0.05。

组别 高糖刺激 低 糖刺激 对照组 转染组 6.90±0.64 14.38±0.66a 6.69±0.54

7.78±0.72

表 2 大鼠注射链脲佐菌素后不同时间段血糖变化 (x _±s , mmol/L) Table 2 Blood glucose changes in rats at different time after streptozotocin injection

表注:与对照组相比, a

P < 0.05。 造模后时间 对照组 (n =4) 造 模组 (n =16) 24 h 48 h 7 d

14 d 5.43±0.54 5.44±0.54 5.51±0.46 5.46±0.52 12.69±1.26a 21.00±3.22a 21.43±3.44a 20.78±3.72a 表 3 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠血糖的影响 (x _

±s , mmol/L) Table 3 Effect of PDX-1 transfected adipose-derived mesenchymal stem cells on blood glucose level in diabetic rats 表注:与对照组相比, a P < 0.05;与糖尿病组相比, b P < 0.05。 时间 移植组 (n =8) 糖尿病组 (n =8) 对照组 (n =4) 移植前 移植 3 d 移植 7 d 移植 14 d 21.48±3.13a 14.01±2.08a 9.42±1.51ab 7.90±1.28b 21.00±3.17a 19.75±1.89a

18.89±2.33a 18.26±2.32a 5.42±0.58 5.45±0.46 5.44±0.58

5.47±0.48

表 4 PDX-1转染脂肪间充质干细胞移植对糖尿病大鼠体质量的影 响 (x _

±s , g) Table 4 Effect of PDX-1 transfected adipose-derived mesenchymal stem cells on body mass in diabetic rats 表注:与对照组相比, a P < 0.05;与糖尿病组相比, b P < 0.05。

时间 移植组 (n =8) 糖尿病组 (n =8) 对照组 (n =4) 移植前 移植 3 d 移植 7 d

移植 14 d 157.3±3.1a 159.4±2.8a 164.6±1.5ab 168.7±2.5b 158.3±2.4a 156.7±1.8a 152.2±3.3a

148.6±2.3a

170.4±4.8

169.5±4.6 170.5±5.0 170.2±4.8

史光军,等 . PDX-1基因转染人脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化及移植治疗 1型糖尿病 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

2067

www. CRTER .org

的方式,能够诱导其向胰岛样细胞方向分化,用脂肪干细 胞衍生来源的胰岛素细胞进行细胞替代疗法, 在未来 1型糖 尿病治疗方面具有广阔的研究前景和应用价值。

作者贡献 :实验设计为史光军,实验实施为白国立、谭雪莹、朱 继军,资料搜集为史光军、白国立。

利益冲突 :所有作者共同认可文章无相关利益冲突。

伦理问题 :实验方案经青岛市市立医院伦理委员会批准,脂肪组 织取材已经取得患者 /家属知情同意,实验过程中对动物的处置符合 2009 年《 Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理 学标准的条例。

文章查重 :文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测系统进行 3次查重。

文章外审 :文章经国内小同行外审专家双盲外审,符合本刊发稿 宗旨。

作者声明 :第一作者及通讯作者对研究和撰写的论文中出现的不 端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据 (包括计算机数据库 ) 记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁,可接受核查。

文章版权 :文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关 协议。

开放获取声明 :这是一篇开放获取文章,文章出版前杂志已与全 体作者授权人签署了版权相关协议。根据《知识共享许可协议》 “署 名 -非商业性使用 -相同方式共享 3.0”条款,在合理引用的情况下, 允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展,同时允许 任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献, 并为之建立索引,用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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