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时间:2020-07-16 04:48  编辑:浏阳肺炎

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白灵侧耳水渍状斑点病初探

近几年白灵侧耳(Pleurotusnebrodensis)水渍状斑点病(wetblotchdisease)频繁发生,对罹病样品进行显微观察和病原菌分离,并对附生优势菌株进行分子鉴定和致病性研究。结果表明,在水渍状病变组织内未发现和分离到细菌和其它真菌;病斑表面的附生优势菌株L1和F1分别为Pseudomonassp.和Arthrobactersp.,回接试验检测无致病性,初步推断该病害不是由细菌或真菌侵染引起的。

白灵侧耳(白灵菇);水渍状斑点病;食用菌

白灵侧耳(Pleurotusnebrodensis)又称白灵菇,我国于20世纪80年代人工驯化栽培成功[1,2],90年代中后期开始商业化栽培,发展迅速,至2010年我国白灵侧耳的年总产量已经达到30万吨,成为我国重要的特色珍稀食用菌之一。随着白灵侧耳栽培规模的扩大,病害也日益严重。笔者对天津市蓟县白灵侧耳生产调查时发现,一种典型症状为菌盖表面出现水渍状斑点的病害(以下简称水渍状斑点病,wetblotchdisease),在一般菇房中发生率在60%~80%,通常不影响产量,但是严重降低子实体品质,给白灵侧耳生产造成很大损失。

目前已报道的食用菌斑点病(blotchdisease)多数是细菌性病害,如双孢蘑菇(Agaricusbisporus)褐斑病(brownblotchdisease)、黄斑病(yellowblotchdisease)和姜黄色斑点病(gingerblotchdisease)的病原分别是托拉斯假单胞菌(Pseudomonastolaasii)[3]、姜黄色假单胞菌(P.gingeri)[4,5]和蘑菇假单胞菌(P.agarici)[6]。目前尚没有关于白灵侧耳水渍状斑点病的研究报道。以期为明确白灵侧耳水渍状斑点病发病原因提供参考,笔者在河北省遵化市和天津市蓟县的白灵侧耳生产基地进行发病程度和发病规律调查,并采集样品,在实验室内对病害进行发病原因初步分析,现将研究结果报道如下。

1材料与方法

1.1病害调查

河北省遵化市平安城镇和天津市蓟县出头镇均是我国白灵侧耳主产区,该地区白灵侧耳的主栽品种是“中农1号”和“ACCC50869”,一般在8月中下旬制袋,栽培主要原料为棉籽壳和木屑,采用砌泥墙模式出菇,常规方法管理[7]。在出现水渍状斑点病过程中均未采取药剂或特殊的防治措施。随机选择平安城镇平一村和出头镇中峪村各3个白灵侧耳生产大棚,每个菇棚栽培“中农1号”8000袋左右,“ACCC50869”2万袋左右。本研究对这6个菇棚进行水渍状斑点病发病情况调查,采用直接计数法记载发病率[8]。

1.2样品采集

从中国农业科学院农业资源与农业区划研究所实验菇房(I组)、平一村(II组)和中峪村(III组)生产大棚采集3组带有水渍斑点的新鲜子实体样品,带回实验室进行病原研究。

1.3病原分析

1.3.1显微镜检查

从3组样品中,每组随机取3个罹病子实体,对病变组织和健康组织进行切片;组织切片加盖盖玻片后,适当按压,用显微镜(OlympusBX51)40倍物镜观察菌丝的粗细、分枝和锁状联合等形态特征;组织切片放在玻片上的水滴中,加盖玻片轻压后,立即放在显微镜40倍物镜下检查是否有混浊的细菌溢流出;将切片移走,水滴干燥后通过火焰固定,革兰氏染色观察。

1.3.2分离培养

1.3.2.1细菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体,分别选择一个病斑进行细菌的分离。首先用70%的酒精表面消毒后,把子实体沿病斑边缘掰开,将表皮组织用灭菌的解剖刀切去,然后切取每边约3mm的水渍状病变组织块,置于200μL灭菌水中,用灭菌玻璃棒研碎,静置10min,用灭菌的移植环蘸取悬液在R2A琼脂培养基(BDDifcoTM)平板上划线接种,将培养皿倒置,25℃培养,观察菌落生长情况。

1.3.2.2真菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体,分别选择一个病斑进行真菌分离[8]。切取每边约3mm的水渍状病变组织块接种到PDA平板上,25℃培养,观察菌丝萌发及菌落生长情况。

1.3.2.3斑点表面附生细菌的分离

每组样品随机取3个罹病子实体,分别选择一个病斑进行附生细菌的分离。用无菌的解剖刀切取一块3mm×3mm的表皮组织,置于装有500μL无菌水,采用涡旋振荡法分离附生细菌,梯度稀释法制作浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释悬液[9]。分别取100μL悬液涂布于R2A琼脂培养基平板上,25℃培养,观察24、48、72和96h菌落生长情况。

1.4分离菌株的分子鉴定

挑取纯化后的细菌菌体,置于200μLTE缓冲液(10mmol/LTris-HCl,1mmol/LEDTA,pH=8.0)中振荡1min,10000g离心5min,收集沉淀;加200μLTE缓冲液振荡30s,离心5min,收集沉淀;再加入200μLTE缓冲液振荡30s,沸水浴10min;然后10000g离心5min,收集上清液作为模板DNA。使用通用引物fd2(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和rp1(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)[10]扩增16SrDNA。PCR反应体系为50μL,其中10×PCR缓冲液5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,正向和反向引物(5μmol/L)各2μL,TaqDNA聚合酶[宝生物工程(大连)有限公司]1U,模板DNA2μL。PCR反应程序为94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,36个循环;72℃7min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。利用试剂盒[AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKitVersion2.0,宝生物工程(大连)有限公司]按照说明书切胶纯化PCR产物,然后由上海英骏生物技术有限公司利用引物fd2和rp1进行测序。将获得的序列去除引物,并进行拼接,获得16SrDNA序列。将获得的16SrDNA序列用ClustalX2软件比对,将序列完全相同的菌株分为一组。将每一组的16SrDNA序列与EzTaxonserver2.1数据库进行比对,选择同源性较高的模式菌株作为参照菌株,利用Mega5采用邻接法(NeighborJoining)构建系统发育树。

张瑞颖,等:白灵侧耳水渍状斑点病初探

1.5优势菌株致病性测定

利用白灵侧耳菌株ACCC50869进行优势菌株的致病性测定,选择直径在2~3cm健康的菇蕾作为接种对象。将纯化的优势菌株用接种针挑取少许,直接穿刺菇蕾表面接种,温度8~10℃、湿度85%下,常规管理[7],观察发病情况。每个优势菌株接种3个菇蕾。

2结果与分析

2.1发病情况

本研究发现,在平安城镇平一村和出头镇中峪村所调查的6个菇棚中,发生水渍状斑点病的栽培品种全部为ACCC50869,其发病率达60%~80%,而未发现中农一号发生该病害。该病害主要发生在12月份至翌年的2月份,这段时间菇棚内的温度一般在-5~8℃。子实体形成之后,往往在开袋疏蕾之前,菇蕾上斑点已经产生,随着子实体的生长,斑点逐渐扩大。有症状的菇蕾呈无规律分布,且斑点症状往往同时出现,未发现蔓延或传播的迹象。

2.2症状

白灵侧耳水渍状斑点病的典型症状是在子实体的表面出现水渍状斑点,随着子实体的生长发育,水渍状斑点常常凹陷;斑点一般呈圆形或椭圆形,大小不等,直径多为0.2~0.8cm;病斑下面的子实体菌肉组织也呈水渍状,深度一般为0.2~0.5cm(封三图1)。水渍状病斑的表面光滑,无腐烂或坏死等症状,也没有菌脓或絮状物等细菌或真菌病害的典型病症。无异味,水渍状斑点一般在菇蕾期开始出现,在子实体的生长发育过程中水渍病斑不断扩大和凹陷,但是在子实体生长发育的后期,部分水渍状斑点症状消失。

Fig.1TypicalsymptomsofblotchdiseaseinP.nebrodensis

2.3显微观察结果

利用显微观察到,病斑组织菌丝的粗细、分枝和锁状联合等形态特征与正常白灵侧耳子实体组织切片的一致,未发现其它类型真菌菌丝、产孢结构和孢子。

显微镜低倍视野下,病斑组织切片无混浊的细菌溢流出,革兰氏染色也未发现细菌菌体。

2.4病变组织块内分离结果

水渍状病变组织块未分离出细菌。

水渍状病变组织块在PDA培养基上培养,24h时组织块周围开始萌发出白色绒毛状菌丝,之后逐渐形成白色绒毛状菌落,菌落形态均一。形态、长势以及生产速度与正常的白灵侧耳子实体组织分离形成的菌落形态一致。显微镜观察其菌丝的粗细、分枝和锁状联合与正常的组织分离形成的菌丝类似。

2.5斑点表面附生细菌的分离

水渍状斑点表面附生细菌的分离实验中,各组的10-1、10-2、10-3稀释度的悬液涂布的R2A平板上均长出细菌菌落。其中实验室出菇房(I组)样品上分离的菌落比较一致,而另外两组样品上分离的菌落比较杂乱,形成多种形态和颜色各异的菌落。这三组样品的水渍状斑点表面的附生细菌数量都不高,仅为103~104CFU/mm2。

2.6附生优势菌株的初步鉴定

3组样品共挑取75个优势菌株,利用引物fd2和rp1扩增的16SrDNA片段大约为1.5kb。测序后,经ClustalX2软件比对,I组上分离的15株细菌16SrDNA相同(L1);而II组和III组样品上分离的60株则分为18组(F1~F18),其中F1为29株,其它各组分别为1~3株。L1和F1分别为实验室和大田样品病斑的优势菌。

与EzTaxonserver2.1数据库中的模式菌进行比对,L1与Pseudomonasgessardii(CIP105469T)16SrDNA序列相似性最高,为99.006%,同时根据16SrDNA序列构建系统发育树,将L1暂定为假单胞菌属细菌(Pseudomonassp.);F1与多色节杆菌(Arthrobacterpolychromogenes)(DSM20136T)16SrDNA序列相似性最高,为99.875%,同时根据16SrDNA序列构建系统发育树,将F1暂定为节杆菌属细菌(Arthrobactersp.)。

根据16SrDNA序列分析发现,I组样品上并未分离到F1菌株,而II组和III组样品上也未分离到L1菌株。也就是说,不同地点采集的白灵侧耳样品,其水渍状斑点表面的附生细菌种类不同。

2.7致病性检测结果

回接试验中,接种L1、F1以及其它31个优势菌株的菇蕾均未出现水渍状斑点。

3讨论

白灵侧耳水渍状斑点病严重影响子实体的商品性状,给白灵侧耳生产带来非常大的损失。本研究从蓟县和遵化的白灵侧耳生产大棚以及实验室的出菇房采集罹病样品,显微观察和分离培养均未在水渍状病变组织内发现细菌和其它真菌;从水渍状斑点表面分离到少量的附生细菌,数量大约为103~104CFU/mm2;不同地点采集的样品上,其附生细菌的种类不同;分离到的L1和F1两组优势附生菌在回接试验中均未表现出致病性。

天津市和河北省大棚内栽培白灵侧耳一般是11月到翌年的4月出菇,该病害主要发生在12月份至翌年的2月份,3、4月份随着菇棚内温度的升高,发病程度降低,甚至不发病。初步推断白灵侧耳水渍状斑点病症状表现与出菇时温度有关,还需要进一步的研究验证。

双孢蘑菇褐斑病等食用菌子实体细菌性病害在潮湿条件下,病斑表面有一层菌脓[11,12],常散发出异味;双孢蘑菇疣孢霉病[13]和轮枝霉病[14]等子实体真菌性病害,在感染部位的表面有一层棉毛状病原菌菌丝或分生孢子等现象。在水渍状斑点发生和发展过程中,斑点表面一直没有出现明显的菌脓,以及其它真菌形成的菌丝或产孢结构等现象。组织分离结果表明该病变组织在PDA培养基上能正常萌发形成菌落,表明水渍状病变组织未发生坏死。在白灵侧耳子实体生长发育的后期,部分水渍状斑点能够恢复正常。水渍状病变组织显微镜切片观察结果表明菌丝形态与子实体正常组织的菌丝形态无明显差异。这些现象和特征也表明白灵侧耳水渍状斑点病与常见的食用菌子实体细菌和真菌引起的侵染性病害不同。真菌子实体内的空气通道(airchannels)[15]和菌丝间空隙主要是由菌丝细胞壁表面的疏水蛋白(hydrophobin)通过疏水作用维持的[15-19]。裂褶菌(Schizophyllumcommune)的疏水蛋白基因sc4被敲除后,导致子实体的空气通道充水[17],呈水渍状;另外构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、脉孢菌(Neurosporacrassa)和稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)疏水蛋白基因rodA[20]、Eas[21]和Mpgl[19]被敲除后,均使气生菌丝或分生孢子囊呈水渍状。白灵侧耳子实体水渍状斑点病的症状与疏水蛋白基因敲除后的表型类似,因此推断白灵侧耳水渍状斑点病可能与菌丝细胞内疏水蛋白基因的表达有关。要进一步揭示白灵侧耳子实体水渍状斑点病的发生机制,还需要对白灵侧耳子实体疏水蛋白基因的表达调控规律进行深入研究。

另外本研究未对该病害进行病毒相关研究,尚不能确定白灵侧耳水渍状斑点病与病毒的关系。

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PreliminaryStudyontheWetBlotch

DiseaseofPleurotusnebrodensis

ZHANGRuiying1,HUDandan2,ZUOXuemei1,GUJingang1,HUQingxiu1*

1KeyLaboratoryofMicrobialResourcesCollectionandPreservation,MinistryofAgriculture,

InstituteofAgriculturalResourcesandRegionalPlanning,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,

Beijing100081,China;2BeijingAcademyofScienceandTechnology,Beijing100089,China

Inrecentyears,theincidenceofwetblotchofPleurotusnebrodensis,adiseasecharacterizedbywater-filledlesionsonthemushroompileus,hasincreased,causingseriouslossestogrowers.Inthisstudy,samplesweretakenfromdiseasedfruitbodiesingreenhouseslocatedinHebeiProvinceandTianjinCity.Fungalmyceliaandbacteriawereisolatedfromthediseasedtissueandfromthesurfaceofwetblotchlesions,andexaminedbymicroscopy.Predominantbacterialstrainswereidentifiedbasedon16SrDNAprofiles.Noexogenousbacteriaorfungiweredetectedinthediseasedtissue,but75strainsofepiphyticbacteriawereisolatedfromthesurfaceofwetblotchlesionsandseparatedintonineteengroups,L1andF1-F18.L1contained15strainshaving16SrDNAsequences99.0%similartoPseudomonasgessardii,andF1contained15strainshaving16SrDNAsequences99.9%similartoArthrobacterpolychromogenes.However,noneoftheseortheotherpredominantstrainswereshowntobetheetiologicagentofwetblotchdisease.OurpreliminarilydataindicatedthatwetblotchdiseaseofP.nebrodensismaybenotbecausedbyfungalorbacterialpathogens.

Pleurotusnebrodensis;wetblotchdisease;ediblemushroom

。

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