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时间:2020-07-04 11:00  编辑:武都饭店

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T SPOT TB技术用于结核的辅助诊断

孟成艳张舒金嘉琳张文宏

近年来,我国结核病的发病率有上升趋势,临床 上经常会遇到一些症状不典型的结核病和肺外结核 病,而目前可用于诊断结核病的方法有限,同时又缺 乏快速敏感的实验室技术,为结核病的早期诊断与 治疗带来困难。酶联免疫斑点法(enzyme.1inked immunospot assay,ELISPOT)技术是一种新型的免疫 酶技术,从单细胞水平检测分泌抗体细胞或分泌细 胞因子细胞…1。由ELISPOT发展而来的T SPOT TB (结核感染T细胞斑点试验)技术用于检测结核感染 后特异性T细胞分泌的7干扰素(IFN.7),并据此结 果判断是否感染结核。

T SPOT TB技术原理

该方法源于Mahairas等在1996年发现的一段 存在结核分枝杆菌(简称结核杆菌)中名为“RDl”的 基因序列心J,而在卡介苗菌株和大部分环境中的分 枝杆菌基因中则缺乏RDl序列。RDl编码产生2种蛋白:ESAT.6和CFP.10(culture filtrate protein), ESAT-6和CFP.10作为特异性抗原刺激机体特异性 T细胞产生IFN.7。

根据这一原理,T SPOTrB技术是利用结核杆菌 感染者外周血单核细胞(PBMC)中存在结核特异性 T细胞,这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺 激后分泌IFN.7而设计的T细胞免疫斑点试验。 PBMC、结核特异的混合抗原A和混合抗原B(分别 为ESAT.6和CFP.10的部分多肽片段),与对照试剂 一起加入预先包被抗抗体的微孔培养板进行培养。 当PBMC中存在特异性T细胞时,培养液中加入的 结核杆菌特异混合抗原多肽A和B将刺激其分泌。 分泌的被微孔板上的抗IFN.7捕获,再次加人的碱 性磷酸酶标记并针对不同表位的抗体与被捕获的结 合,滞留在微孔板表面,显色底物溶液在反应部位被

基金项目:国家重点基础研究发展计划(2005CB523102)

作者单位:200040上海,复旦大学附属华山医院感染科

通讯作者:张文宏,E-mail:[email protected] 酶分解形成不溶性色素沉淀斑点。每1个斑点代表 1个IFN.7分泌细胞(结核特异的效应T细胞)。根 据斑点数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的 效应T细胞,而对结核杆菌感染进行辅助诊断。

T SPOT TB操作方法

采集8m1患者的血液加入含枸橼酸钠的CPT 采血管内,分离PBMC,加入细胞培养液,轻轻重悬 细胞。在已包被抗IFN.7抗体微量板的4个孔中, 分别加入细胞培养液作为阴性对照,植物血凝素 (PHA)作为阳性对照,结核杆菌特异混合多肽A和 B分别含ESAT.6与CFP.10(Oxford Immunote Ltd., Oxford,UK)。然后在每个孔中加入含250000个细 胞的上述悬液。把微量板放在37℃培养16~20h 后,用PBS洗板4次,加入碱性磷酸酶标记的小鼠抗 人IFN.7单克隆抗体,在2~8℃下孵育1h。孵育后 再用PBS液洗板4次。最后每孔加入显色底物液 BCIP/NBTPLUS,室温中静置7min后观察结果,并用 计算机辅助成像分析系统进行斑点阅读与统计 (ELISPOT试剂盒由上海复星科技有限公司提供)。 第1孔为阴性对照孔,第2孔为阳性对照孔。如出 现斑点,说明试验成功。第3、4孔为实验孔,当测试 孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果:①如果 阴性对照孔斑点数为0。5个,测试孔斑点数减去阴 性对照孔斑点数≥6;②如果阴性对照孔斑点数≥6个,测试孔斑点数必须≥2倍的阴性对照孔斑点数。

T SPl0T TB的临床应用

我院传染科首次将T SPOT TB技术用于临床, 辅助诊断疑似结核患者,并取得一定成效。现将1例经T SPOT TB技术鉴别诊断后得到有效治疗的病 例报道如下。

1.病例报道男性,62岁。入院前3个月无诱 因下出现颈部疼痛,1个月前出现左上肢麻木,进行 性乏力,伴发热,体温在38℃左右,无畏寒,寒战,无 咳嗽,咳痰,无消瘦,盗汗等。人院体检,精神较萎, 左侧颈部可扪及肿大淋巴结,质软,无压痛。左上肢

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肌力3级,肌张力可,余肢体肌力,肌张力正常。 脑脊液检查:白细胞2×106/L,总蛋白983mg/ L,葡萄糖3.9mmol/L,氯化物120mmol/L。颈椎 MRI:多发椎体异常信号伴硬膜增厚(图1)。头颅 MRI示:双侧额叶、侧脑室旁多发斑点状异常信号 (图2)。高度怀疑颈部与颅内异常信号为转移性肿 瘤,但骨髓穿刺、腹部B超、腹部cT、颈部淋巴结活 检均未发现异常。

图1治疗前、后颈椎MRI

A:该患者治疗前颈椎MRI:在颈2—4椎体有异常信号,并有硬 脊膜增厚;B:治疗后同一部位的MRI:可见原先的异常信号降低,硬 脊膜增厚略有减轻。

图2头颅MRI

可见侧脑室旁有圆形异常信号。

2.结果用T SPOT TB检测该患者血液标本, 结果阳性(图3)。于是对该患者行诊断性抗结核治 疗,方案为四联(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁 醇),同时加用甲泼尼松30rIlg。治疗3d后,患者体 温平,治疗1周后,患者颈部疼痛好转,左上肢肌力 逐渐恢复,2周后,患者左上肢肌力基本恢复正常。 复查颈部MRI示:原先异常信号减弱,硬脊膜增厚 减轻(图lB)。患者出院时仍维持四联抗结核治疗, 激素减为泼尼松20mg,嘱患者随访。从该患者的 治疗反应诊断为结核性脑脊髓膜炎和椎体结核。

图3该病例的ELISPOT结果

1:阴性对照孔;2.为阳性对照孔;3、4:实验孔。图中可见第3孔 中出现大量斑点,为阳性结果。每个斑点代表1个分泌IFN.7的T 细胞。用计算机辅助成像技术进行斑点计数得到4个孔的斑点数分 别为2、832、401和0。

3.讨论该患者是肺外结核感染,缺乏典型的 结核中毒症状,如消瘦、盗汗等,影像学检查发现颈 椎、头颅有异常信号,从形态学上倾向于转移性肿 瘤,但对常见肿瘤的筛查未发现原发肿瘤的迹象,脑 脊液检查只有蛋白较高,细胞数无明显升高。常见 的结核检查,如PPD试验、脑脊液抗酸染色、涂片均 为阴性,淋巴结活检也未发现结核感染病灶。在这 种情况下,我们用T SPOT TB技术对其血液进行检 测,结果提示阳性。当然,T SPOT TB不是诊断结核 的金标准,所以我们不能就此确诊为结核。于是对 患者行诊断性抗结核治疗,从抗结核治疗的反应来 看,患者症状明显好转,由此判断治疗有效,证实该 患者为结核感染。

目前,临床诊断结核的方法有限。结核菌素试 验(聊)是临床常用筛查结核的免疫学方法,虽然操 作简单,观察结果方便,但由于其有较高的假阳性和 假阴性,对临床结核病的诊断意义不大。细菌学是 诊断结核的金标准,但培养需要2个月的时间,而且 阳性率取决于采集标本中细菌的数量,不利于早期 诊断与治疗。影像学作为辅助诊断方法,对活动性 肺结核诊断有一定价值,但对肺外结核诊断存在困 难。T SPOT TB法作为一种新的酶免疫检测方法在 国外(主要是英国与美国)新近刚开始用于结核杆菌 感染的检测,它不仅敏感性高,特异性强[3]3,而且操 作简单,需时少,一般2d就能看到结果。在国内也 已经进入试验性诊断阶段,但尚缺乏大规模的临床 实验及评价。

Susan等在一项前瞻性、双盲队列研究中得到 T SPOT TB的敏感性为83%,显著高于皮试的敏感

性63%。同时,非结核患者不会产生假阳性。在<  万 方数据

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3岁、合并H1V感染及营养不良的儿童中,皮试的敏 感性显著下降,而T SPOT TB的敏感性没有显著性 改变[4J。另有研究得到T SPOT TB在普通人群中的 敏感性为96%,在健康人群中的特异性为100%,在 HIV阳性患者中的特异性为92%b J。目前该技术已 在国外广泛用于活动性结核病和结核潜伏感染者的 诊断及HⅣ合并结核感染的检测,用于区别结核感 染者与BCG接种以及耐药结核杆菌感染的快速检 测。

4.总结综上所述,T SPOT TB技术作为一种 新的检测结核感染的酶免疫学方法,其敏感性与特 异性显著高于传统的研,而且所需时间少,有利于 结核病的早期诊断与治疗,意义重大,对隐性结核感 染也有诊断价值。但由于价格昂贵,不如佟T操作 简便易行,限制了该方法在临床的推广与应用。我 院首次将该方法试验性用于辅助临床诊断,并取得 一定成效,在临床症状不典型、PPD诊断不明确、涂 片及培养均为阴性的疑似结核病患者中,辅以T SPOT TB方法,可以帮助确诊结核感染。

参考文献

1.侯世芳,许贤豪,刘广志,等.酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术的应用.中国神经免疫学和神经病学杂志,2002,

10:200~202

2.Lalhani A.Spotting latent infection:the path to better tuberculosis contr01.Thorax.2003,58:916—918

3.Philip C,Roger H,Annette F,et a1.Large-scale evaluation of enzyme—linked immunospot assay and skin test for diagnosis of Mycobactefium tuberculosis infection against a gradient of exposure in the Gambia.Clin Infect Dis,2004,38:966—9r73 4.Liebeschuetz S,Bamber S,Ewer K,et a1.Diagnosis of tuberculosis in South African children with a T-cell.based assay:a prospective cohort study.1ancet,2004,364:2196— 2203

5.Chapman AL,Munkanta M,Wilkinson KA,et a1.Rapid detection of active and latent tuberculosis infection in HⅣ. positive individuals by enumeration of Myeohatefium tuberculosis-specific T cells.AIDS,2002,16:2285~2293

(收稿13期:2006-06-19)

新书介绍

病原真菌生物学研究与应用

由长期致力于医学真菌学临床与基础研究的廖万清、吴绍熙两位教授主 编的《病原真菌生物学研究与应用》是“病原生物学丛书”之一,将于2006年9月由化学工业出版社正式出版。《病原真菌生物学研究与应用》一书共分11章,本书在介绍真菌生物学及基因组学知识的基础上,阐明了真菌感染的病原 学、流行病学、免疫学及诊治方法,涵盖浅部和深部真菌感染的诸多内容;同 时,着重讲述了分子生物学方法诊疗的原理与技术,以及耐药机制、疾病动物 模型等内容。结合作者的实践经验,书中对于药物不合理使用、SARS、AIDS、 器官移植与真菌感染的关系也进行了系统阐述。内容丰富、新颖、实用。可供 医学检验和临床诊断及相关专业的医生、科研和技术人员以及药物研发人员 参考,也可作为医学院校的医学真菌学教材。该书的及时推出对于拓展病原 真菌研究和生物医学研究的视野、延伸生命科学研究的触角、促进我国相关学 科的发展将有一定的推动作用,并对该领域同行的基础研究、应用开发研究以及教学工作会有所裨益。 更多详情或更新资料,请登录:WWW.cip.Corn.cn;化学工业出版社邮购热线:010.64982530

(梁静丽)

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