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八一影院免费观看香蜜沉沉烬如霜

时间:2020-07-03 06:09  编辑:渭源林业局

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【论著】

基金项目:中国博士后科学基金特别资助项目(200902355);中国博士

后科学基金面上资助项目(20080440816

);广西教育厅科研立项项目(200911LX38)作者简介:农清清(1971-),女,副教授,博士后,从事环境毒理学研究。

微囊藻毒素-LR 对人肝癌HT17细胞周期及细胞凋亡的影响

农清清1,2,Takeuchi T 3,Komatsu M 3,张志勇1,何敏1

1.广西医科大学公共卫生学院职业卫生与环境卫生学教研室,广西南宁530021;

2.广西医科大学博士后科研流动站;

3.日本鹿儿岛大学医齿学综合研究科环境医学研究室

摘要:目的研究微囊藻毒素-LR (MC -LR )对人肝癌HT17细胞周期、凋亡的影响及其可能的作用机制。

方法

调整HT17细胞密度为1×104/孔,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO )、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、2.0、5.0

μmol/L 的MC-LR 染毒组和去铁敏(DFO ,1mmol/L )染毒组以及MC-LR (0.8μmol/L )+DFO (1mmol/L )染毒组培养24h ,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT )法检测细胞生长情况。调整HT17细胞密度为1×105/孔,分别设终浓度为0(溶剂对照)

、MC-LR (0.8μmol/L )染毒组和DFO (1mmol/L )染毒组以及DFO (1mmol/L )+MC-LR (0.8μmol/L )染毒组培养24、48h ,采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。结果

高剂量(≥0.8μmol/L )MC-LR 染毒24h 后细胞存

活率明显低于溶剂对照组(P <0.01),DFO+MC-LR 染毒组细胞存活率高于0.8μmol/L MC-LR 染毒组(P <0.05)。与溶剂对照组相比,MC-LR 染毒24、48h 后G 0/G 1期细胞所占比例和细胞凋亡率均增高,S 期细胞所占比例下降(P <0.05或P <0.01);DFO+MC-LR 染毒组与MC-LR 染毒组染毒24h 后各期细胞所占比例无差异(P >0.05)。DFO+MC-LR 染毒组染毒24h 后细胞凋亡率低于MC-LR 染毒组(P <0.01)。结论

MC-LR 可导致HT17细胞在G 0/G 1期发生阻滞及

细胞凋亡,可能与其诱发的氧化应激、蛋白质磷酸化状态紊乱有关。

关键词:微囊藻毒素-LR ;细胞周期;细胞凋亡中图分类号:R994.6

文献标志码:A

文章编号:1001-5914(2011)06-0496-03

Effects of MC -LR on Cell Cycle and Cell Apoptosis in Human Hepatoma HT17Cells NONG Qing -qing ,Takeuchi T ,Komatsu M ,et al .Department of Occupational and Environmental Health ,School of Public Health ,Guangxi Medical

University ,Nanning ,Guangxi 530021,China Abstract :Objective To explore the effects of microcystin-LR (MC-LR )on cell cycle and cell apoptosis.Methods Human

hepatoma cell lines HT17were cultured at a density of 1×104

cells/well.The cells were treated with solvent (0.1%DMSO),

MC-LR (0.05-5.0μmol/L ),deferoxamine (DFO ,1mmol/L)or MC-LR (0.8μmol/L)in the presence of DFO (1mmol/L)for 24h ,then the

growth of cells was evaluated by MTT assay.HT17cells (1×105

/well)were treated with solvent (0.1%DMSO),MC-LR (0.05-5.0μmol/L ),DFO (1mmol/L)or 0.8μmol/L MC-LR in the presence of DFO (1mmol/L)for 24or 48h.Flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis.Results After exposure to 0.8μmol/L and higher concentrations of MC -LR for 24h ,the cell viability in MC-LR-treated group was significantly lower than that of solvent control group (P <0.01).The cell viability in the group that received combined treatment with DFO and MC-LR (combined treatment group)was significantly higher than that of 0.8μmol/L MC -LR -treated group (P <0.05).Compared with solvent control group ,the percentage of cells in G 0/G 1phase and apoptosis significantly increased ,and the cells in S phase decreased after exposure to MC-LR for 24and 48h (P <0.05or P <0.01).No significant difference in the percentage of cells in different phases was observed between combined treatment group and MC-LR-treated group.The percentage of apoptosis in combined treatment group was significantly lower than that of MC-LR-treated group (P <0.01).Conclusion MC-LR can induce cell cycle arrest at G 0/G 1phase and increase cell apoptosis ,in which oxidative stress and perturbation in protein phosphorylation may be concerned.

Key words :Microcystin-LR ;Cell cycle ;Cell apoptosis 微囊藻毒素(Microcystins ,MC )是由富营养化水体中的铜绿微囊藻、水华鱼腥藻、颤藻等产生的一组具有肝脏毒性的单环多

肽毒素。迄今为止,已发现MC 有80多种异构体[1,2]

。在众多异构

体中,存在最为普遍,含量较多,毒性较大的是微囊藻毒素-LR (microcystin-LR ,MC-LR )。MC-LR 作用的主要靶器官为肝脏,大剂量急性暴露会引起肝脏的急性中毒,使肝细胞肿胀、浓缩和坏死,肝脏大面积出血,甚至死亡[1]。很多研究表明,MC-LR 可导致氧化应激、DNA 损伤、细胞骨架崩解,从而产生毒性作用[3-5]。

但迄今为止,MC-LR 的细胞毒性作用机制尚未完全阐明。本实验拟用不同剂量MC-LR 对人肝癌HT17细胞株进行染毒,观察MC-LR 对HT17细胞生长、细胞周期、细胞凋亡的影响以及抗氧化剂去铁敏(deferoxamine ,DFO )对此过程的干预作用,以进一步探讨MC-LR 的毒性作用机制。1材料与方法

1.1细胞株、主要仪器与试剂

人肝癌HT17细胞株由日本东

北大学老年医学研究所细胞资源中心惠赠。

CKX41型倒置显微镜(日本Olympus 公司),CO 2培养箱(美国Thermo 公司),MPR-A4i 型酶标仪(日本Tosoh 公司),FACS

Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)。

MC-LR(纯度>98%,瑞士Alexis公司),0.1%二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司),青霉素和链霉素(美国Gibco-BRL 公司),四甲基偶氮噻唑蓝(MTT,日本同仁化学研究所),伊格尔最低必需培养基(MEM)、胎牛血清、DFO、溴化乙啶(PI)均购自美国Sigma公司。

MC-LR染毒溶液的配制:取适量的MC-LR,用0.1%二甲基亚砜溶解,临用时现配。

DFO染毒溶液的配制:取适量的DFO,溶解于水中,得到浓度为10mmol/L的DFO溶液。

1.2细胞培养将HT17细胞置于MEM培养基(含10%加热失活胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)中,于37℃,5%CO2和95%O2条件下培养。每3d换液,传代培养1次或收获细胞。

1.3检测细胞活性的MTT试验参照Komatsu等[6]的方法进行MTT试验。调整HT17细胞密度为1×104/孔接种于96孔板,培养24h后,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO)、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、

2.0、5.0μmol/L的MC-LR染毒组和DFO(1 mmol/L)染毒组以及MC-LR(0.8μmol/L)+DFO(1mmol/L)染毒组,每组设3个平行孔。继续培养24h后,每孔加50μl MTT溶液,37℃孵育3h,弃去培养液,加入100μ1的DMSO,室温下摇床振荡5min后,用酶标仪测定570nm波长处的吸光度(A)值。并计算细胞存活率(细胞存活率=A

染毒组/A溶剂对照组×100%)。

1.4细胞周期和细胞凋亡的流式细胞术检测参照文献[7],取对数生长期的HT17细胞,以1×105/孔接种于6孔板,培养24h 后,分别设终浓度为0(溶剂对照,0.1%DMSO)、MC-LR(0.8

μmol/L)染毒组和DFO(1mmol/L)染毒组以及DFO(1mmol/L)+ MC-LR(0.8μmol/L)染毒组培养24、48h后,用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化细胞,PBS洗涤2次后,用70%乙醇-20℃固定过夜。离心除去固定液,并以PBS洗涤1次,所得细胞用50μg/ml 溴化乙啶(含RNA酶100μg/ml)37℃避光染色30min。用流式细胞仪检测被溴化乙啶染色的细胞,分析DNA含量。每次每个样品检测10000个细胞。由于凋亡细胞的DNA含量低于正常

二倍体细胞含量,在二倍体细胞的G

/G1峰前出现的一个亚二

倍体峰(sub-G

1

峰)即代表凋亡细胞峰。根据此峰的面积可计算凋亡细胞百分率。使用Cylchred细胞周期分析软件测定细

胞周期中G

/G1、S和G2/M各期细胞所占的比例以及凋亡细胞百分率[8]。

1.5统计学方法所有实验重复做3次。实验数据均以x±s表示。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。率间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1MTT试验结果表1可见,MC-LR浓度为0.8~5.0μmol/L 时,细胞存活率明显低于溶剂对照组,差异有统计学意义(P< 0.01);随着MC-LR染毒浓度的升高,HT17细胞存活率呈下降趋势。DFO+MC-LR染毒组细胞存活率高于0.8μmol/L MC-LR 染毒组,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2MC-LR染毒HT17细胞周期的变化表2可见,与溶剂对

照组相比,MC-LR染毒24、48h后G

/G1期细胞所占比例增高,S期细胞所占比例下降,差异均有统计学意义(P<0.05或P< 0.01),而且呈时间-效应关系。

DFO+MC-LR染毒组染毒24h后各期细胞所占比例与MC-LR染毒组比较,差异均无统计学意义。

2.3MC-LR染毒HT17细胞凋亡的变化表3可见,与溶剂对照组相比,MC-LR染毒24、48h后细胞凋亡率均增高,差异有统计学意义(P<0.01)。DFO+MC-LR染毒组染毒24h后细胞凋亡率低于MC-LR染毒组,差异有统计学意义(P<0.01)。

3讨论

MC-LR具有较强的肝毒性和促癌活性。有研究表明,MC-LR的毒性效应表现为剂量上的双向性,即低剂量(nmol/L~pmol/ L水平)的MC-LR具有促进细胞增殖以及肿瘤形成的效应,而高剂量(μmol/L水平)的MC-LR则可引起细胞死亡或凋亡[9]。本研究结果显示,0.05~0.4μmol/L的MC-LR染毒HT17细胞24h,未观察到明显的细胞增殖效应或细胞活性抑制效应;而高剂量(≥0.8μmol/L)MC-LR染毒细胞可明显抑制HT17细胞生长。

DFO作为一种铁离子的螯合剂,可以阻断Fenton反应中过氧化氢(H

2

O2)降解为羟自由基(OH-),从而减轻细胞的氧化损伤[10]。本研究发现,DFO可在一定程度上阻断MC-LR对HT17细胞的生长抑制作用,提示除了诱发氧化应激,MC-LR还可能通过其他作用机制抑制细胞生长。笔者采用PI对细胞进行染色后分析细胞周期,以明确MC-LR引起的细胞生长抑制作用是表1MC-LR染毒对人肝癌HT17细胞活性的影响

MC-LR(μmol/L)

0.05

0.1

0.2

0.4

0.8

2.0

5.0

0.8

DFO(mmol/L)

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

0.0

1.0

1.0

细胞存活率

100.21±1.21

101.29±9.12

99.48±4.50

99.22±2.09

96.59±6.58

77.04±2.49a

66.70±3.82a

50.12±3.98a

99.71±3.08

90.77±2.06b

(n=3,x±s,%)

注:a与溶剂对照组比较,P<0.01;b与0.8μmol/L MC-LR染毒组比较,P<0.05。

表2MC-LR染毒对HT17细胞周期的影响

MC-LR

(μmol/L)

0.0

0.8

0.8

0.0

0.8

DFO

(mmol/L)

1

1

时间

(h)

24

24

48

24

24

49.90±0.83

61.75±2.13a

73.81±0.56b

49.73±0.34

59.27±2.46

37.68±0.37

26.89±2.02a

13.67±0.78b

38.94±1.69

28.27±2.22

12.42±1.08

11.37±1.65

12.54±0.32

11.33±1.59

12.47±1.63

G0/G1期S期G2/M期

(n=3,x±s,%)注:与溶剂对照组比较,a P<0.05,b P<0.01。

表3MC-LR染毒对HT17细胞凋亡的影响

MC-LR

(μmol/L)

0.8

0.8

0.8

DFO

(mmol/L)

1

1

时间

(h)

24

24

48

24

24

2.65±0.87

12.2±0.77a

9.98±0.22a

2.30±0.58

7.52±0.65b

凋亡率

(n=3,x±s,%)注:a与溶剂对照组比较,P<0.01;b与MC-LR染毒24h组比较,P<0.01。

天津市北辰区学校生活饮用水卫生学监测

徐国和,赵永胜

天津市北辰区疾病预防控制中心,天津300400

关键词:水;卫生调查;学校

中图分类号:R122.2文献标志码:E文章编号:1001-5914(2011)06-0498-01

为了解北辰区学校生活饮用水水质卫生状况,于2010年对北辰区30所普通中学、2所职业大学、2所寄宿制小学、36所小学校各采集1份水样。49所学校饮用降氟设备出水(市政供水),15所学校以自备井水为水源,6所学校饮用桶装纯净水。按GB/T 5750—2006《生活饮用水标准检验方法》检测,以GB5749—2006《生活饮用水卫生标准》进行评价。调查显示,88%的学校能够按照《学校卫生工作条例》规定要求,向学生及时提供开水或纯净水,但有12%的学校未向学生提供开水,90.8%学校对学生开展经常性的饮水卫生健康教育。15%的学校自备井没有供水安全卫生制度,没有供水管理员,水源防护工作较差。

共检测水样70份(表1),除浑浊度(合格率为94.29%)、菌落总数(合格率为81.43%)、耗氧量(合格率为91.43%)、氟化物(合格率为95.71%)外。其他检测指标均合格。48份水样所有检测指标均合格,合格率为68.57%。其中,市政供水监测49份,合格率为71.43%;自备井水监测15份,合格率为60%;桶装纯净水检测6份,合格4份。4份水样浑浊度超标,均值为10NTU,13份水样菌落总数超标,范围为150~280cfu/ml;6份水样耗氧量超标,均值为5.6mg/L;3份水样氟化物超标,均值为3mg/L。

说明部分学校的生活饮用水受到了不同程度的污染,提示广大师生禁止直接饮用生水,学校应重视对生活饮用水的消毒管理。本区的深井水通过降氟器过滤后供给饮用,在监测结果中,15份自备井水样本中,3份样本氟化物结果为3mg/L。提示有关部门应积极开展降氟设备的定期核查和自备井水的监测,确保学校生活饮用水符合国家卫生标准。

(收稿日期:2011-01-27修回日期:2011-04-20)

(本文编辑:杜宇欣)表1天津市北辰区学校不同类型生活饮用水合格率

饮水类型

市政供水

自备水源

桶装纯净水

合计

样本数(件)

49

15

6

70

浑浊度

97.96

80.00

100.00

94.29

菌落总数

81.63

86.67

66.67

81.43

耗氧量

91.84

86.67

100.00

91.43

氟化物

100.00

80.00

100.00

95.71

(%)

否与细胞周期的改变有关。本研究结果显示,0.8μmol/L MC-LR

染毒细胞24h后,细胞周期发生改变,表现为G

/G1期细胞所占比例增多,S期细胞所占比例减少,差异均有统计学意义(P< 0.05或P<0.01);表明高剂量的MC-LR可诱导细胞周期阻滞于G0/G1期,抑制细胞的增殖。但DFO与MC-LR联合染毒未能逆转MC-LR引起的细胞周期阻滞。

很多研究表明,细胞周期是由周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors,CKIs)、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)以及其他调节CDK磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶所调控[11]。而MC-LR是极强的蛋白磷酸酶抑制剂,能抑制细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PPl和PP2A的活力,从而打破细胞内蛋白磷酸化/脱磷酸化的平衡而产生毒性作用[1]。因此,推测MC-LR可能通过改变这些细胞周期调控蛋白的磷酸化水平,引起细胞周期阻滞。本研究还发现,0.8μmol/L MC-LR染毒细胞24h后,可

引起sub-G

1

峰的细胞明显增多,表明细胞凋亡率增加,而DFO 能明显抑制MC-LR诱导的细胞凋亡。提示MC-LR引起的细胞凋亡可能与其诱导的氧化应激有关,至于MC-LR对氧化应激系统包括活性氧(ROS)产生、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)形成、超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化物酶活力的影响及其在MC-LR诱导细胞凋亡中的作用仍有待进一步深入研究。参考文献:

[1]Gehringer MM.Microcystin-LR and okadaic acid-induced cellular effects:a dualistic response〔J〕.FEBS Lett,2004,557:1-8.

[2]张慧珍,李超锋,张丰泉,等.微囊藻毒素-LR对体外培养大鼠睾丸

支持细胞中活性氧及丙二醛含量的影响〔J〕.环境与健康杂志,2010,27(10):866-868.

[3]Weng D,Lu Y,Wei Y,et al.The role of ROS in microcystin-LR-induced hepatocyte apoptosis and liver injury in mice〔J〕.Toxicology,2007,232:15-23.

[4]Zegura B,Lah TT,Filipic M.The role of reactive oxygen species in microcystin-LR-induced DNA damage〔J〕.Toxicology,2004,200:59-68.

[5]Komatsu M,Furukawa T,Ikeda R,et al.Involvement of mitogen-activated protein kinase signaling pathways in microcystin-LR-induced apoptosis after its selective uptake mediated by OATP1B1and OATP1B3〔J〕.Toxicol Sci,2007,97:407-416.

[6]Komatsu M,Sumizawa T,Mutoh M,et al.Copper-transporting P-type adenosine triphosphatase(ATP7B)is associated with cisplatin resistance〔J〕.Cancer Res,2000,60:1312-1316.

[7]Kitazono M,Takebayashi Y,Ishitsuka K,et al.Prevention of hypoxia-induced apoptosis by the angiogenic factor thymidine phosphorylase 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1998,253:797-803.

[8]Khan N,Afaq F,Syed DN,et al.Fisetin,a novel dietary flavonoid,causes apoptosis and cell cycle arrest in human prostate cancer LNCaP cells〔J〕.Carcinogenesis,2008,29:1049-1056.

[9]帅怡,王彦琴,尹建勋,等.MTT法观察微囊藻毒素-LR对原代大鼠肝细胞的双向毒性作用〔J〕.现代预防医学,2010,37(12):2289-2291.

[10]Al-Ghamdi SS,Chatterjee PK,Raftery MJ,et al.Role of cytochrome P4502E1activation in proximal tubular cell injury induced by hydrogen peroxide〔J〕.Ren Fail,2004,26:103-110.

[11]韦伟,龚建平,裘法祖.细胞周期调控与肿瘤的发生发展〔J〕.癌症,1999,18(1):95-97.

(收稿日期:2011-04-20修回日期:2011-05-30)

(本文编辑:韩威)

【监督监测】

。

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